高温胁迫下玉米钙依赖蛋白激酶基因的表达及功能

张宇萍，杨少玉，胡秀丽，杨浩

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

受全球气候变暖影响，高温热害已成为威胁中国玉米产量的主要因素之一。高温热害会直接损伤玉米叶片，阻碍花丝和花药的生长发育，影响灌浆周期，最终导致产量下降。开展玉米耐高温基因的挖掘与鉴定，是培育耐高温玉米新品种的基础。为了降低环境中各种胁迫所引起的伤害，植物进化出多种机制去调节自身生长、生理、代谢等活动以适应不良环境。其中，钙离子作为重要的第二信使，在细胞内通过短暂的浓度改变就可以将环境信号传递下去，引发下游一系列的生理反应[1-2]。植物中已鉴定到4类感受钙离子信号的传感器，分别是钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases，CCaMKs)，类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurin B-like interacting protein kinases，CIPKs)，钙依赖型蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinase，CDPKs)和钙依赖型蛋白激酶相关蛋白激酶(CPK-related protein kinases，CRKs)[3]。其中，CDPKs是目前植物中研究较多的一类蛋白激酶，几乎介导了植物生长发育的全部过程及在多种胁迫响应中发挥重要作用。

典型的CDPKs蛋白包含4个结构域：N端可变的结构域(variable N-terminal domain，VNTD)、Ser/Thr蛋白激酶域(Ser/Thr protein kinase domain，KD)、自抑制连接域(auto-inhibitory junction domain，JD)和C端具有EF手型结构的类钙调素调控结构域(C-terminal calmodulin-like domain，CaMLD)。其中，VNTD上可以发生棕榈酰化和豆蔻酰化的修饰，影响CDPKs的膜定位，同时VNTD也决定CDPKs与底物的特异结合[4-5]。CDPKs的KD结构域序列保守，在钙离子浓度低时，被JD结构域结合并丧失激酶活性；当外界刺激导致钙离子浓度增加时，钙离子可以与CaMLD结构域的EF手型结构结合，通过构型改变暴露出被JD封闭的KD结构域从而恢复激酶活性[6]。

CDPKs在植物适应非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。目前CDPKs家族基因在多个物种中已有报道。其中，拟南芥AtCDPK10在脱落酸和Ca2+介导的干旱胁迫下的气孔调节中发挥作用[7]。葡萄VaCDPK20参与调控寒害和干旱响应[8]。对水稻已知的CDPKs进行系统研究发现，OsCDPK6，OsCDPK13，OsCDPK17，OsCDPK25在不同的胁迫响应中发挥重要作用，其中OsCDPK6和OsCDPK25的表达受高温诱导[9]。但是，玉米中有关CDPKs在高温胁迫方面的研究很少。本研究以拟南芥和水稻中的CDPKs蛋白序列为参考，从玉米数据库中鉴定到32个CDPKs同源蛋白，进一步通过生物信息学技术对玉米家族基因进行序列特征、基因结构、染色体定位、细胞定位及功能预测等分析，随后利用高温处理玉米幼苗，通过实时荧光PCR定量技术，筛选并验证受高温胁迫诱导的CDPKs，为进一步开展相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

试验于2020年在河南农业大学室内培养箱进行，以玉米郑单958为试验材料，培养箱条件和光周期分别为28 ℃/22 ℃和14 h /10 h (白天/黑夜)，光照度为400 μmol·m-2·s-1，利用霍格兰营养液水培玉米幼苗至两叶期(7 d左右)。高温胁迫处理将培养箱温度由28 ℃按照2 ℃·h-1的速度升至42 ℃，并且在42 ℃维持1 h，共计处理8 h，其他条件不变。

1．2 方法

1.2.1 玉米CDPKs的鉴定 利用已报道过的拟南芥和水稻的CDPKs蛋白质序列，通过在玉米的数据库进行BLAST比对(https://maizegdb.org/)，这些候选蛋白分别通过Pfam(http://pfam.xfam.org/)，SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)和NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)验证是否具有CDPKs保守结构域。若存在CDPKs结构域，则认为该候选蛋白属于CDPKs蛋白。

1.2.2 玉米CDPKs基因系统发育分析 使用Clustal X (1.81版本)程序对全长蛋白序列进行比对，进一步运用MEGA 5.0中的邻接法(NJ)构建了系统发育树。

1.2.3 玉米CDPKs基因染色体定位和基因结构分析 利用植物基因组数据库(http://www.phytozome.net/)中提供的染色体位置信息，查询玉米CDPKs基因在染色体上的定位，并用MapChart 2.2将定位信息可视化。利用基因结构显示服务器(GSDS)程序(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对ZmCDPKs的外显子和内含子结构进行分析。

1.2.4 玉米CDPKs蛋白结构和酰基化修饰预测 使用PROSITE(https://prosite.expasy.org/)预测ZmCDPKs的蛋白结构域；使用PlantsP(http://plantsp.genomics.purdue.edu/)进行豆蔻酰化预测；使用CSS-Palm 4.0(http://csspalm.biocuckoo.org/index.php)进行棕榈酰化预测。

1.2.5 玉米CDPKs细胞定位和功能预测 使用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)以及WOLF PSORT的(https://wolfpsort.hgc.jp/)对ZmCDPKs的亚细胞定位进行预测。

1.2.6 玉米高温胁迫响应的CDPKs的筛选及验证 为了鉴定高温胁迫响应的ZmCDPKs基因，当幼苗生长到两叶期后，处理组在42 ℃的光照培养箱进行8 h的高温处理[10]，每组包含14株幼苗，处理组有3个生物重复。随后利用Trizol法[11]提取高温处理过的0.2～0.4 g的叶片RNA，琼脂糖凝胶观察其完整度；使用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。最后使用ABI StepOnePlus型号的荧光定量PCR仪器对ZmCDPKs基因的表达量进行定量，使用ZmActin7作为内参基因，同时使用 2-△△Ct的方法计算各个基因于内参基因ZmActin7的相对表达量，确定其基因表达丰度。

1.2.7ZmCDPK6调控网络分析 高温胁迫下，ZmCDPK6的表达量显著升高，随后利用STRING(https://string-db.org/)分析工具对ZmCDPK6的蛋白互作网络进行解析，可信度设置为0.7。

2 结果与分析

2.1 玉米CDPKs的鉴定和生信分析

通过将拟南芥和水稻的CDPKs蛋白序列在玉米数据库MaizeGDB中进行比对分析，并对获得的同源蛋白进行蛋白结构域预测，最终从玉米数据库中鉴定到32个ZmCDPKs，相对分子质量13.6～62.9 kD(表1)。其中，ZmCDPK6，ZmCDPK22和ZmCDPK23没有EF hands序列，ZmCDPK29，ZmCDPK19只有2个EF hands序列，ZmCDPK14有3个EF hands序列，其他均有4个EF hands序列(表1)。

表1 鉴定到的32个ZmCDPKs的基本特征Table1 Basic characteristics of 32 identified ZmCDPKs

为了研究ZmCDPKs在基因组上的分布，查询Phytozome网站上的玉米基因组数据库后发现，除9号染色体外，鉴定到的32个ZmCDPKs基因在其他染色体上均有分布，其中8号染色体上分布最多(图1)。

图1 鉴定到的ZmCDPKs基因在玉米染色体上的分布Fig.1 Genome-wide distribution of ZmCDPKs genes on the maize chromosomes

为了解析ZmCDPKs之间的进化关系，将32个玉米ZmCDPKs，29个拟南芥AtCDPKs和34个水稻OsCDPKs进行序列比对，构建了无根系统树。结果显示，这些CDPKs可以形成4个明显的分支(图2)。其中，分支I是最大的分支，包含10个ZmCDPKs，而分支Ⅳ是最小的分支，包含6个ZmCDPKs；而没有EF hands序列的ZmCDPK22和ZmCDPK23同属于分支Ⅳ，表明系统进化分析结果与结构域及序列之间具有良好的对应关系。系统进化分析结果也暗示ZmCDPKs在定位和功能上可能存在差异。对ZmCDPKs的亚细胞定位进一步进行预测分析发现，除ZmCDPK22定位于细胞核和细胞质外，其余的ZmCDPKs均定位于膜上，这与它们N端可以发生酰基化修饰密切相关，并且棕榈酰化主要发生在C4位点，而豆蔻酰化主要发生在G2位点(表1)。

利用MEGA 5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)，设置bootstrap重复1 000次，构建了CDPKs的根系进化树。CDPKs分成4个明显的分支。来自玉米的CDPKs成员用红色表示。The phylogenetic tree was constructed with MEGA 5.0 using neighbor-joining method with 1 000 rapid bootstrap replicates.CDPKs are divided into 4 distinct branches.CDPKs from maize are shown in red.图2 玉米、拟南芥和水稻间系统发育关系比较Fig.2 The comparative phylogenetic analysis in maize,Arabidopsis and rice

2.2 玉米高温胁迫响应的CDPKs的筛选及验证

通过实时荧光定量PCR的方法，检测出了32个ZmCDPKs基因在高温胁迫下的表达情况，除5个无法准确定量的ZmCDPKs基因外，剩余27个可以定量的ZmCDPKs基因中，有18个ZmCDPKs的表达量受高温诱导，其中ZmCDPK6的表达量上调最显著。此外，还有5个ZmCDPKs的表达量在高温胁迫下降低，分别是ZmCDPK15，ZmCDPK16，ZmCDPK25，ZmCDPK26和ZmCDPK30。这些受高温诱导表达的基因均不在系统进化树的第Ⅳ个分支上，而高温胁迫下表达量下调的都在第Ⅳ个分支上(图3)。

选择ZmActin7作为内参基因，使用 2-△△Ct的方法计算各个基因相对表达量，数据为平均值±标准差，每个基因的定量均有3次生物学重复。ZmActin7 was selected as the internal reference gene,and the relative expression of each gene was calculated using the 2-△△Ct method.The data were mean±standard deviation,and the quantitative analysis of each gene had 3 biological repeats.图3 利用qRT-PCR验证玉米ZmCDPKs基因的表达情况Fig.3 The expression levels of ZmCDPKs verified by qRT-PCR

2.3 ZmCDPK6调控网络分析

鉴于ZmCDPK6受高温诱导表达量显著升高，对其功能进行进一步分析和预测。通过序列比对发现，玉米ZmCDPK6与拟南芥AtCDPK19和水稻OsCDPK20的蛋白序列高度同源，序列相似度分别达到了74%和86%(图4)。

图4 玉米ZmCDPK6与水稻及拟南芥中同源序列比对 Fig.4 Amino acid sequence alignment between ZmCDPK6 and its homologous in rice and Arabidopsis

分析已有RNA-seq数据发现，ZmCDPK6在果皮和胚根中高度表达，并且还受到盐胁迫和低温胁迫诱导表达(图5)。

图5 ZmCDPK6表达数据Fig.5 Expression data associated with ZmCDPK6

此外，但利用其同源蛋白进行互作网络分析发现，ZmCDPK6可能会与其他的CDPKs，以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BIK)、呼吸爆发氧化酶同源蛋白D(RBOHD)、脱落酸反应元件结合因子1(ABF1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SRK2E(OST1)、C4 -二羧酸转运蛋白/苹果酸转运蛋白(OZS1)、钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶(CaMK4)之间存在互作(图6)。

String蛋白互作网络分析中，采用可信度设置为0.7。BIK1：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；RBOHD：呼吸爆发氧化酶同源蛋白D；ABF1:脱落酸反应元件结合因子1；OST1：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SRK2E；OZS1：C4-二羧酸转运蛋白/苹果酸转运蛋白；CaMK4：钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶。String analysis of protein interaction network,and the credibility was set as 0.7.BIK1:serine/threonine protein kinase;RBOHD:respiratory burst oxidase homologous protein D;ABF1:abscisic acid reaction element binding factor 1;OST1:serine/threonine protein kinase SRK2E;OZS1:C4-dicarboxylic acid transporter/malic acid transporter;CaMK4:calcium/calmodulin dependent protein kinase.图6 利用String软件分析ZmCDPK6的潜在互作网络Fig.6 String software was used to analyze the potential interaction network of ZmCDPK6

3 结论与讨论

对玉米中鉴定到的32个ZmCDPKs基因进行系统分析后发现，32个ZmCDPKs基因具有内含子和外显子，分布在9号染色体以外的染色体上。对玉米的32个CDPKs基因进行系统进化分析，结果表明，它们可以分为4个主要分支，并且受高温抑制的ZmCDPKs全部位于第Ⅳ分支。进一步分析ZmCDPKs的亚细胞定位发现，ZmCDPK22定位于细胞核和细胞质外，其定位可能受到某些刺激的影响发生转移，该现象已经被鉴定到，而其他ZmCDPKs定位在不同的质膜上，其定位与G2位点的豆蔻酰化以及C4位点棕榈酰化之间存在密切关联。进一步利用实时荧光定量PCR的方法检测高温处理后玉米叶片中ZmCDPKs基因的表达情况，筛选出ZmCDPK6显著受高温诱导，对其蛋白序列进行分析发现，它与拟南芥AtCDPK19及水稻OsCDPK20序列高度相似。拟南芥中的研究表明，AtCDPK19在干旱胁迫下脱落酸介导的信号传导和气孔保卫细胞中H2O2稳态维持中发挥作用[12]。进一步分析ZmCDPK6的表达模式发现，该基因在所有组织均有表达，但在种皮和胚根中表达量最高，同时还受到非生物胁迫比如盐胁迫和温度胁迫诱导[13-17]。在对ZmCDPK6进行蛋白互作网络分析发现，ZmCDPK6可能与BIK1，RBOHD，ABF1，OST1，OZS1以及CaMK4之间存在互作关系。其中，BIK1作为一个类受体胞质激酶，在植物免疫反应中起核心作用，可以激活对坏死性病原体的抗性反应[18]；而RBOHD受钙离子调控，可以产生活性氧，在与病原体拮抗及脱落酸依赖ROS信号中发挥作用[19-20]；而ABF1被鉴定为一种与脱落酸反应元件结合的蛋白质，可介导ABA反应的转录调控[21]；OST1则作为激酶，可以激活脱落酸(ABA)信号通路，调节许多ABA反应，如对干旱、植物病原体或大气相对湿度降低的气孔关闭[22-24]。以上结果均表明，ZmCDPK6是一个受胁迫诱导的，可以在高温胁迫中发挥重要作用的钙依赖型蛋白激酶，进一步对其功能进行深入研究，将为揭示玉米耐高温机制以及培育耐高温玉米新品种提供重要的理论基础。