罗非鱼原核表达基因研究进展

贺扬 余巧玲 王均 覃川杰 李华涛

（1. 内江师范学院生命科学学院，内江 641100；2. 长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室，内江 641100）

原核表达即在原核生物体内的基因表达，是借助基因克隆技术把外源目的基因与特定载体相结合构建表达载体，再将表达载体导入表达菌株中，使外源基因在表达菌株中得以表达。原核表达系统包括表达载体和表达菌株，根据不同的分类方式可以对表达系统进行分类，从表达调控的方式，可分为组成型和诱导型；从表达产物的定位，可分为分泌型和不分泌型；从产物纯化的方式，可分为融合蛋白和非融合蛋白。随着基因序列测定技术的成熟，各种基因的序列被测定出来，研究人员把目光转向各种基因的功能，原核表达为基因功能的研究奠定了基础，为人、动物、植物和微生物基因体外表达提供了技术支撑，为某基因的蛋白功能研究提供了原材料，也可为药物、疫苗的研发奠定了基础。

全球人口预计到2050 年将达到96 亿［1］。传统的畜牧和捕获渔业生产几乎无法满足人类对动物蛋白质的需求。为适应当前和未来的需求，水产养殖正稳步发展并以每年全球年增长率超过7%的速度进行增长［2］。全球鱼类年消费量已增至19 kg/人［3］。罗非鱼被指定为人类饮食的一个理想组成部分，尤其是孕妇和正在成长的孩子。2018 年，罗非鱼已成为产量仅次于鲤鱼的第二大养殖品种［4］。而且罗非鱼不仅是重要的养殖品种，也是鱼类生理学和生态学的重要研究模型。

国内外，关于罗非鱼营养、养殖、免疫的研究报道十分丰富，其中罗非鱼相关基因的原核表达对这些基因的功能研究、免疫调节剂的开发等都具有重要意义。因此，本论文对现有罗非鱼原核表达基因进行了综述，以期为进一步深入研究罗非鱼奠定基础。

1 原核表达技术

原核表达是借助基因重组技术得以实现。基因重组技术始建于1972 年，Jackson 等［5］用同一种限制性内切酶对猿猴某病毒的DNA 和λ 噬菌体DNA进行剪切后，利用DNA 连接酶把上述两种DNA 分子重新连接，产生了一种新的DNA 分子，即重组DNA。在1973 年，Cohen 等［6］利用相同技术将一段外源DNA 片段与质粒DNA 连接起来，构成了一个重组质粒。该重组质粒又进一步转入大肠杆菌，成功构建了完整的基因克隆体系。

最先被应用且目前最成熟的表达体系是大肠杆菌表达体系。它具有快速、高产量、IPTG 简易快速诱导表达等特点。PET 表达系统是目前应用较为广泛的表达系统，可以满足研究者对载体融合标签、二硫键形成、蛋白质外运等需求。pET 载体的各种启动子及宿主为各类不同蛋白表达产量的最大化提供了重要的选择。而带有His 标签的pET 载体可增加目的蛋白的溶解性，减少包涵体的形成，为后续的蛋白检测、纯化及蛋白相关功能研究奠定基础。

2 罗非鱼中原核表达的基因使用的载体及菌株

罗非鱼品种非常多，约有40-50 种。其中部分罗非鱼已经引种至世界各地的热带和亚热带地区，作为动物蛋白的重要供应来源。1956 年罗非鱼被首次引入我国，目前我国已成为罗非鱼养殖的第一大国。然而，随着罗非鱼的大量养殖也出现了一些问题，比如雌雄成熟时间的不同、各种病害频发。为更好的服务罗非鱼养殖业，研究者们对罗非鱼生长、性别调控、繁殖以及免疫相关基因都做了大量的研究，其中原核表达特定基因应用非常广泛（表1）。在众多罗非鱼品种中，以尼罗罗非鱼的研究最为广泛，其他罗非鱼如奥利亚罗非鱼、吉富罗非鱼也有少量研究。原核表达的基因以免疫相关因子为主，也有与繁殖相关的因子。大多数的原核表达蛋白均用于功能研究或制备单/多克隆抗体。从表达体系来看，原核表达的载体以pET 系列为主。

3 罗非鱼中原核表达重组蛋白的应用与价值

原核表达具有操作简便、产量丰富、价格低廉等特点，是生产大量目的重组蛋白质的简单且廉价的方法，是替代天然获取的有效手段［41］。使用原核表达技术进行基因的表达，在动物、植物、微生物基因功能的研究和蛋白利用中都得到了广泛的应用：在动物多用于研究疾病或生长相关基因的表达，以大量获得蛋白制备抗体，用于后续机制研究。在植物多用于生长调控有关的基因和一些有巨大价值的蛋白基因的表达。在微生物研究主要围绕毒力基因或致病基因进行表达用于致病机制研究或亚单位疫苗制备。归纳罗非鱼的原核表达基因的用途主要可分为以下3 个方面。

3.1 抗体制备

原核表达技术可大量获得目的蛋白，易于纯化，且具有较好的免疫原性是作为抗原的首选。原核表达的mIgD 具有较强的免疫原性，皮下注射免疫大白兔57 d 后，可产生效价约1∶512 000 的抗体［8］。原核表达的AMH 免疫ICR 小鼠4 次后，血清效价可达1∶2 000［9］。原核表达的Hsc70 免疫日本大耳兔的抗体效价为1∶204 800，且能特异性的识别尼罗罗非鱼Hsc70 蛋白［12］。原核表达Ly75 获得的兔抗Ly75 多克隆抗体成功用于了检测Ly75 在尼罗罗非鱼体内的分布情况［13］。Rentier-Delrue 等［39］参照鲑鳟鱼类的cDNA 文库成功获得了尼罗罗非鱼的GH基因，并实现了GH 的克隆表达，为Melamed 等［42］建立GH 放射免疫测定法提供了兔抗-GH 抗体的原材料，为研究下丘脑和甲状腺对GH 的调节作用奠定了重要基础。丁炜东等［7］利用原核表达技术首次表达了鱼类GnRH 前体蛋白，并获得了高效价的抗体，为后续研究免疫抑制控制鱼类性成熟奠定了基础。当蛋白序列过大时，截短表达的蛋白也可作为抗原用于制备特异性抗体。使用原核表达的截短IgM 蛋白制备获得多克隆抗体，可特异性检测尼罗罗非鱼组织和血清中IgM 的含量［43］。因此，无论是全序列还是截短序列经原核表达后，均可作为抗原，免疫动物，获得抗血清。

表1 罗非鱼原核表达基因

3.2 目的蛋白功能分析

蛋白的功能研究对于目的蛋白的纯度和浓度都具有极高的要求。天然的目的蛋白是研究功能的最佳选择，但其提取方法十分复杂，甚至无法提取。如Kaiya 等［44］在研究生长激素释放肽对生长激素和催乳素的影响时，首先需要将生长激素释放肽从胃提取、纯化、并鉴定出来，然后进行后续实验。该过程操作复杂，对试剂和仪器的要求很高，而且纯度和浓度往往难以达到要求。而如若采用直接合成大分子蛋白质的办法，将花费昂贵。因此如果原核表达的蛋白具有活性，研究者们将优选原核表达获得蛋白进行活性研究。Hu 等［38］研究pET -BL21（DE3）表达IGF-2 表达量发现：每114.5 g/L 的干细胞可产生9.69 g/L IGF-2，即IGF-2 的表达量高达总蛋白含量的11.3%，且保有活性。周林燕［24］分析原核表达的17β-羟类固醇脱氢酶1 的酶活发现：重组蛋白能高效催化A 和T 之间的转化，也能高效催化E1 和E2 之间的互相转化，转化率高达98.5%。原核表达tiPRLs 可用于生物学功能研究［35］。因此，原核表达技术在蛋白功能分析上，可作为重要的蛋白供应途径。

3.3 目的蛋白开发利用

原核表达蛋白对于开发生产新型药物、绿色抗菌剂等都具有重要意义。罗非鱼Hepcidin 抗菌肽早在2009 年和2011 年就被证实具有抗肿瘤、抗乙脑功能［45-46］。然而这些研究都是基于合成肽的基础完成的。虽然抗菌肽分子量小，氨基酸数量仅有20 余个，但合成肽的价格依然昂贵，难以实现大量生产。2012 年，文雅等［30］研究发现原核表达的罗非鱼Hepcidin 对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌都具有抑菌活性，表明原核表达的Hepcidin 同样具有抗菌活性。瞿兰等［40］应用原核表达技术大量获得了奥利亚罗非鱼的3 种C 型溶菌酶，比较分析了原核表达的3 种C 型溶菌酶与斑节对虾C 型溶菌酶和草鱼C 型溶菌酶的活性，发现原核表达的溶菌酶具有较强的抗菌活性。

原核表达的细胞因子为研究新型免疫佐剂提供新思路。鱼类的某些细胞因子如IL-1、干扰素能作为免疫佐剂，增加鱼体的特异性免疫。吴杰等［47］研究发现原核表达的斑点叉尾鮰IL-1β 可作为疫苗佐剂，提高亚单位疫苗PSCPI 的免疫效果。陈德芳等［48］研究也表明原核表达的IL-8 可作为免疫佐剂。在罗非鱼上，Suhee［34］研究发现原核表达的尼罗罗非鱼的IL-1β 具有生物学活性，有望作为免疫佐剂进行开发利用。王瑞等［49］研究发现真核表达的Hsp70 可作为罗非鱼的免疫佐剂，如若原核表达的Hsp70 也具有活性，则有望开发免疫佐剂。

因此，原核表达蛋白在新型药物研发和免疫调节剂开发中都具有较好的应用前景。

4 原核表达的局限性

随着原核表达的广泛应用，研究者们创造了多种多样的原核表达系统。就以有史以来大肠杆菌表达系统中最强的pET 为例。Novagen 公司单pET 系统就推出了pET 载体41 种、融合标签14 种、表达宿主37 种。研究者可根据要求选择二硫键形成、高严谨表达、串联序列表达、提供稀有密码子、控制表达水平、营养缺陷等。如莫桑比罗非鱼的IGF-2蛋白，虽然在pGEX-2T 和pET28 中都能进行表达，且均具有生物学活性，但pET28 表达体系的产量远高于pGEX-2T［42-43］。原核表达系统的优化虽然最大限度的满足了研究者的需求，但如果坚持使用原核表达系统，那么对于载体和宿主的选择和优化，将费时费力费钱。

而且，尽管有大量的宿主和载体进行选择，对于真核生物——罗非鱼而言，无法表达和表达后无活性依然是研究者最为担忧的问题。由于原核表达系统常常无法实现转录后糖基化、甲基化等修饰，因此真核基因在原核系统里可能出现表达后没有活性的现象。而且原核表达系统的密码子偏爱性与真核表达系统存在差异，这也使得许多基因在原核系统中不能表达或表达量低。另外，原核表达系统表达十分高效，这也使得蛋白质在表达过程中难以正确折叠，最终以包涵体的形式表达出来，使得蛋白失活。

因此，如果不能使用常规的原核表达体系实现蛋白表达和活性。研究者们通常会考虑使用真核表达系统进行试验，如酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫表达系统等。Harel 等［50］使用毕赤酵母成功表达了尼罗罗非鱼黄体激素（LH），并对其结构和功能进行了分析。王瑞等［49］使用毕赤酵母表达的Hsp70 蛋白ATPase 与抗原多肽结合具有免疫增强作用。

5 总结与展望

虽然原核表达还存在一些缺点，但是原核表达在分子基础研究中已经是一项不可缺少的技术。即使表达的蛋白无生物学活性，但在多克隆抗体的制备研究中依然表现出很大的优越性，为蛋白的定位定量分析奠定了基础。如果表达的蛋白具有活性，将为蛋白的功能研究与开发提供极大的便利。因此，原核表达蛋白在罗非鱼的研究和应用中占有重要的地位。