微生物发酵青蒿叶和叶渣的研究

丁嘉伟 苏新堯 尹薪项 马婷玉 王晚晴 向丽 冯宝民 王彩霞

（1. 大连大学生命科学与技术学院，大连 116622；2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3. 河北科为先生物科技有限公司，衡水053311；4. 北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

黄花蒿（Artemisia annuaLinn.），民间多称青蒿，为一年生草本，菊科植物，茎直立，上部多分枝，具纵棱线。叶互生，茎中部的叶二回羽状分裂，花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干。青蒿具有清热解暑、除蒸、截疟功效。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸［1］。青蒿除含有抗疟成分青蒿素、青蒿酯钠、蒿甲醚等外，还含有青蒿酸、双氢青蒿素、青蒿醇、青蒿乙素、左旋樟脑等，具有一定的降压、平喘、解热、镇静、抗炎、抗病毒、调节免疫功能等功效［2］。抗疟药物青蒿素即来自于黄花蒿，是中药为数不多的一类新药，其发现者屠呦呦先生也因此获得诺贝尔奖。尽管青蒿知名度高，但是其在中药行业用量不大，除了作为青蒿素提取的原料药外，在动物养殖上有所应用（如青蒿散）。青蒿素提取工艺成熟、价格透明，因此提取青蒿素一般多选择含量高的青蒿品种（1.5%-1.8%）用于降低成本。整体看来，我国青蒿种植及青蒿素原料药制备企业利润低，行业压力大。在青蒿种植过程中，还有许多青蒿素等功效成分含量较低的青蒿，以及青蒿素提取产生的青蒿叶渣，不合理利用则会增加企业支出，造成青蒿资源浪费。近年来，研究发现青蒿素能够有效对抗乙型肝炎、血吸虫病、小细胞肺癌和耐药性癌症。青蒿作为粗饲料，因其具有特殊的香气，适口性较好，不论猪、兔，夏季每天投喂200-400 g，能起到消除暑热和健胃的作用，可使禽畜在炎热天不掉膘，生长繁殖正常，增重快，且疾病少［3］。作为动物保健产品使用可提高动物免疫力，明显抑制鸡球虫的生长和发育［4-5］。因此研究并开发上述青蒿及叶渣并积极寻求新的应用，对延长延伸青蒿保健产品的产业链具有重要意义。

目前市场上的青蒿类动物药多为复方含青蒿药材直接粉碎制备，产品利用率有待进一步提高。微生物尤其是益生菌发酵中药，具有改善中药苦味、降低药材本身毒性等优点，发酵过程破坏药材细胞结构，有利于功效成分释放提高其利用率，还有助于将大分子物质降解为利用度更高的小肽、多糖等，增强动物吸收，发酵中药中的益生菌本身对于可调节动物肠道健康，促进营物质的消化吸收。

本研究以青蒿叶和叶渣作为主要原料，采用微生物发酵模式，将青蒿叶和叶渣功效成分充分释放，探索其作为动物保健产品的可能性，旨为拓宽青蒿原料的应用及产业链提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 实验菌株保存于中国中医科学院中药所1 楼实验室-80℃ 50%甘油管中。植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌均为益生菌，能够改善动物肠道内环境；酿酒酵母菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌有较好的发酵能力，常用在工业发酵中。实验所用菌株生物特性见表1。

1.1.2 试剂 氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、石油醚、丙酮、硫酸均购买自北京化工厂有限责任公司；青蒿素及其衍生物标品购自成都埃法生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉购自索莱宝公司；标准酪蛋白购自美国BD 公司；青蒿叶与青蒿叶渣均由广西仙草堂有限责任公司提供。

1.1.3 仪器 恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司；紫外分光光度计UV-5100B：上海精密仪器；GCMS-QP20：日本岛津；微量XPE/微量分析天平：梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司；漩涡震荡器Vortex-1：上海沪析实业有限公司；真空浓缩机CONCENTRATOR PLUS：德国艾本德公司。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备 里氏木霉、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、酵母菌和毕赤酵母菌菌液接种于30 mL LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化钠）培养基中（比例1∶50），活化两次。取第二次活化菌液接种于100 mL LB 培养基中（比例1∶50），37℃培养24 h，其中酵母菌和毕赤酵母菌30℃培养24 h。

1.2.2 培养基组成成分 7.5 g 青蒿叶/青蒿叶渣、2.5 g 玉米浆、1.25 g 豆粕、1.25 g 麦麸、80 mL 无菌水，121℃湿热灭菌30 min。

1.2.3 发酵 里氏木霉、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌酵、酵母菌和毕赤酵母菌单一菌种菌液接种量接于发酵培养基中（比例1∶50），37℃发酵5 d，其中酵母菌和毕赤酵母菌培养基30℃发酵5 d，每组3 个平行，青蒿叶和叶渣组加入等体积灭菌蒸馏水。每24 h 测定一次OD600，绘制菌株生长曲线。发酵结束后，样品（105±2）℃烘干120 min，小型磨粉机粉碎至粉末，取0.2 g 粉末进行粗蛋白含量测定，取3.0 g 粉末进行粗纤维含量测定，取5.0 g 粉末进行粗脂肪含量测定。

1.2.4 粗纤维、粗蛋白、粗脂肪和功效成分含量测定 粗纤维的测定依据GB6432-86 方法进行［14］，粗脂肪的测定依据GB6433-1994 方法进行［15］，粗蛋白测定采用双缩脲法进行［16］。

青蒿素、青蒿乙素、双氢青蒿酸、青蒿酸提取及测定：准确称取0.1 g 样品放入50 mL 离心管，离心管中加入10 mL 石油醚，超声萃取1 h，室温静置30 min，取9 mL 上清液，减压浓缩制干［17］。GC-MS对青蒿素及其功效成分进行分析鉴定［18］，所用色谱仪为岛津气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010，色谱柱为HP-5（30 mm×0.25 mm×0.25 mm），离子源为EI 源，离子源温度温度，280℃；载气氦气流速1.5 mL/min；进样口温度250℃，分流进样，分流比1∶1，进样量1 μL；柱箱程序升温起始温度100℃，保持1 min；然后以6℃/min 的速度升温至220℃，保持3 min 后以30℃/min 的速度升温至280℃，保持5 min；质谱扫描范围35-500 m/z。

1.2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 7 软件进行统计分析，数据用x-±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSD-t 法，P＜0.05 差异有统计学意义。

表1 供试菌种及其特性

2 结果

2.1 菌株生长曲线结果分析

如图1 所示，青蒿叶和叶渣经菌株发酵后，整体呈上升-平稳-下降的趋势。发酵菌株对数期主要集中于24-72 h，72 h 后培养基中的营养物质快速消耗，不足以维持菌株整体的生长发育，导致菌株生长发育受到抑制，OD600逐渐下降，其中里氏木霉和植物乳杆菌菌株生长情况最好。

2.2 青蒿叶和叶渣粗脂肪、粗蛋白、粗纤维含量测定

如图2 示，粗蛋白和粗脂肪含量整体呈上升趋势，粗纤维含量整体呈下降趋势。发酵前后粗蛋白含量对比，酿酒酵母菌发酵青蒿叶后粗蛋白含量提高了75.59%（P＜0.05），提高最多，其次是地衣芽孢杆菌，其发酵后粗蛋白含量提高了69.28%（P＜0.05）；发酵前后粗脂肪含量对比，植物乳杆菌发酵青蒿叶后粗脂肪含量提高106%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，发酵后其粗脂肪含量提高了74.32%（P＜0.05）；发酵前后粗纤维含量对比，枯草芽胞杆菌发酵后粗纤维含量降低了43.30%（P＜0.05），降低最多，其次是枯草芽孢杆菌，发酵后粗纤维含量降低了42.10%（P＜0.05）。发酵青蒿叶渣后粗蛋白含量对比，酿酒酵母菌发酵后粗蛋白含量提高了85.30%（P＜0.05），提高最多，其次是毕赤酵母菌，其发酵青蒿叶渣后粗蛋白含量提高了44.60%（P＜0.05）；植物乳杆菌和干酪乳杆菌粗脂肪含量提高了87.73%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，发酵后粗脂肪含量提高了57.60%（P＜0.05）；枯草芽孢杆菌发酵后粗纤维含量降低了55.67%（P＜0.05），降低最多，其次是里氏木霉菌，发酵青蒿叶渣后粗纤维含量降低了43.04%（P＜0.05）。综合上述数据看，说明酿酒酵母菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌在对粗蛋白、粗脂肪提高以及粗纤维降低方面最好，可用于发酵生产。

图1 青蒿叶（A）和青蒿叶渣（B）发酵菌株的生长曲线

2.3 青蒿叶和叶渣发酵前后功效成分含量

青蒿叶和叶渣发酵后通过GC-MS 检测，与混合标准品相比，青蒿发酵产物分别在14.914、15.470、18.848、19.334 min 出现与标准品相同质谱图的新峰，见图3 所示，比较青蒿发酵前后功效成分含量变化。

如图4 所示，青蒿叶发酵后，双氢青蒿酸、青蒿酸、青蒿乙素和青蒿素4 种功效成分含量显著升高。与对照组比，枯草芽孢杆菌发酵后双氢青蒿酸含量提高了86.01%（P＜0.05），地衣芽孢杆菌发酵后青蒿酸含量提高了21.49%（P＜0.05），黑曲霉菌发酵后青蒿乙素和青蒿素含量分别提高了88.06%（P＜0.05）、133.27%（P＜0.05）。黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵青蒿叶后，青蒿4 种功效成分含量提升显著。

如图5 所示，青蒿叶渣发酵后，双氢青蒿酸和青蒿乙素两种功效成分整体呈上升趋势。与对照组比较，枯草芽孢杆菌发酵后其双氢青蒿酸含量提高了71.91%（P＜0.05），地衣芽孢杆菌发酵后其青蒿乙素含量提高了94.71%（P＜0.05）。青蒿叶渣经枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵后，产物中青蒿成分含量提升明显，地衣芽孢杆菌具有独特的夺氧机制，不适合与好氧菌进行混合发酵。

3 讨论

微生物发酵青蒿叶和叶渣，提高了粗蛋白、粗脂肪及青蒿素等功效成分含量，降低了粗纤维含量，使青蒿叶和叶渣中的功效成分得到充分释放，增加了作为动物保健产品的可能性，为拓宽青蒿原料的应用及产业链提供理论依据。

中药发酵产物作为动物饲料添加剂方面的应用价值较高，赵帅等［19］研究发现杜仲具有提高动物生产性能、增强机体免疫力、改善畜禽产品品质等多种功能，在日粮中添加发酵杜仲叶粉0.3%饲喂海兰褐蛋鸡，能够显著提升产蛋率2.7%，同时蛋重提高0.6%。乔宏兴等［20］使用植物乳杆菌和屎肠球菌对中药黄芪进行发酵，发酵后产物作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，结果发现，0.6%发酵黄芪添加组断奶仔猪的平均采食量显著提高，证明发酵黄芪产物对断奶仔猪有明显的促生长作用。何玉华等［21］发现，在雉鸡日粮中添加发酵水飞蓟残渣，可提高其采食量和营养物质消化率。根据中药在饲料添加剂方面的应用价值与前景，探索开发青蒿叶和叶渣发酵产物作为动物保健品。

图2 青蒿叶发酵后中粗蛋白（A）、粗脂肪（C）、粗纤维含量（E）、以及青蒿叶渣发酵后中粗蛋白（B）、粗脂肪（D）、粗纤维（F）含量

图3 发酵产物中青蒿素等化合物GC-MS 分析确定

图5 青蒿叶渣发酵后中双氢青蒿酸（A）、青蒿乙素（B）含量

探索开发青蒿叶和叶渣发酵产物作为动物保健品，功效成分含量的多少对动物的生长发育其关键性作用。饲料中粗纤维含量多少同样影响着动物的生长发育，粗纤维含量低，使饲料体积减小，功效成分含量提高，普遍适口性好［22］。里氏木霉、枯草芽孢杆菌能在含有青蒿叶和叶渣的培养基中较好生长，可产生大量的纤维素酶、糖化酶、淀粉酶及植酸酶等酶类，有利于细胞壁的破碎，从而使青蒿叶和叶渣中的功效成分得到充分释放［23］。粗蛋白在机体内以多种小分子蛋白、游离氨基酸和肽发挥作用，是机体内重要的营养元素，可提高机体免疫力，增强氧化分解功能。酿酒酵母菌以及植物乳杆菌等自身含有大量多种蛋白质、氨基酸、微生物等多种营养成分，常用于工业饲料领域，可大量提高发酵产物中蛋白质含量。李漠等［24］研究发现，饲粮中粗蛋白含量升高，貉血清中游离的苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等总氨基酸含量均明显升高，有利于貉的生长发育，为冬毛期获得大张幅皮张奠定基础。粗脂肪含量是判定饲料产品质量和等级的重要指标。根据菌株生长曲线可知，植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌在培养基中的生长情况较好，能够快速生长并积累大量的粗脂肪。植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌作为益生菌具有调节免疫力，抑制致病菌，降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病，维持肠道内菌群平衡等保健作用。

综上所述，黑曲霉菌发酵青蒿叶和叶渣使青蒿素和青蒿乙素含量提高最多，但是在发酵过程中可产生黑曲霉毒素，需要引起注意。酿酒酵母菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌在粗蛋白、粗脂肪提高以及降低粗纤维方面较好，可用于发酵生产。青蒿叶和叶渣通过微生物发酵模式，可大幅度提高功效成分含量，充分发挥药用价值，探索开发新的产品应用于多领域当中，可使中药资源得到充分利用。

4 结论

本研究通过微生物液态发酵青蒿叶和叶渣，发酵后粗蛋白、粗脂肪、青蒿素、双氢青蒿酸、青蒿乙素和青蒿酸的含量均较对照组有所提高，粗纤维含量均较对照组有所降低。青蒿叶和叶渣经酿酒酵母菌发酵后产物中粗蛋白含量均最高，经植物乳杆菌发酵后产物中粗脂肪含量均最高，经枯草芽孢杆菌发酵后产物中粗纤维含量均降低最多。该研究结果为今后进一步探索工厂化发酵生产青蒿动物保健产品提供参考依据。