外周血LTA4H基因多态性rs7971150位点检测在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的临床意义

程炜炜，鲁晓怡，周晓莉，刘明，张青，夏娟，赵云峰

1.上海杨思医院呼吸科，上海200126 2.上海市浦东新区浦南医院呼吸科，上海200125

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是呼吸内科常见病，是一种多种炎症细胞浸润的呼吸道慢性炎症性疾病[1]，多见于中老年人，中国40 岁以上人群患病率为13.7%[2]。白三烯是白细胞活化物质，白三烯A4 水解酶（leukotriene A4 hydrolase,LTA4H）是肺部发生慢性炎症的一个关键酶，能够催化产生白三烯B4（leukotriene B4，LTB4），而LTB4 通过与靶细胞膜上的G 蛋白偶联受体结合引起气道炎症[3-4]。近年来，LTA4H 作为白三烯产成过程中一种重要的限速酶，在有些呼吸系统疾病中对其基因多态性进行了相关的研究[5-6]。LTA4H 上游启动子的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs7971150 影响LTA4H mRNA 在体内的表达[4]，而香烟烟雾可诱导气道上皮细胞LTA4H 的表达[7]。本研究旨在探讨LTA4H基因多态性rs7971150 检测在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的临床意义,以及其与吸烟的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年9月—2020年1月在上海市浦东新区浦南医院呼吸科病房和上海杨思医院呼吸科病房住院的COPD 急性加重（观察组）患者150 例和非COPD 患者150 例（对照组）。AECOPD 患者均符合2017年GOLD 指南制定的AECOPD 标准，纳入标准：COPD 患者主诉症状突然变化超过日常变异范围[8]，具体表现为咳嗽、咳痰、呼吸困难比平时加重，或痰量增多、或咳黄痰，需要改变用药方案；排除标准：（1）严重肾功能、肝功能、心功能不全，血液恶性肿瘤及其他系统肿瘤患者；（2）肺间质性疾病、炎症性疾病；（3）支气管哮喘或支气管扩张症，遗传性疾病史；（4）心肌梗死史、心胸及腹部外科大手术史、脑卒中等；（5）传染性疾病恢复期；（6）孕妇或预计生育的女性；（7）研究者认为不宜纳入本项研究的特殊人群。具备上述任1 项标准的病例不纳入本研究。

观察组中男性104 例，女性46 例，年龄在61～75岁(中位62.5 岁)。对照组中男性96 例，女性54 例，年龄在60～77 岁(中位64.8 岁)，包括支气管扩张急性加重患者80 例、社区获得性肺炎患者70 例，支气管扩张急性加重及肺炎标准均符合支气管扩张及肺炎的有关专家共识及指南[9-10]。根据患者是否吸烟，观察组患者及对照组患者各自分为吸烟组（吸烟烟龄在10年以上，平均每天20 支）及不吸烟组两个亚组。观察组患者吸烟组110 例，不吸烟组40 例；支气管扩张吸烟组43 例，不吸烟组37 例；肺炎吸烟组40例，不吸烟组30 例。性别、年龄以及是否吸烟在观察组与对照组之间的差异无统计学意义（>0.05）。入组所有研究对象均签署知情同意书，本研究已通过上海市浦东新区浦南医院伦理委员会批准（编号为20170704）。

采用imLDR 多重连接酶SNP 分型检测技术[11]，检测所有入选患者外周血TA4Hrs7971150 基因多态性，并测定每位患者动脉血气（pH 值、PaO2、PaCO2）、肺功能FEV1、FEV1%以及6 分钟步行距离。

1.2 研究方法

1.2.1 基因位点测定 清晨采集患者空腹外周静脉血4 mL于EDTA抗凝管中，用试剂盒抽提DNA，置于-20℃冰箱里保存。采用上海天昊生物科技有限公司遗传分析中心的imLDRTM 多重SNP 分型试剂盒对样本进行SNP 位点分型[12]。

rs7971150 位点的上游引物序列为5'-GACTCCTGGTCTCAGTTGGGTGA-3'；下游引物序列为 5'-TCCCTTGGATTGTATGCCAAAAA-3'；连接引物序列分 别 为 rs7971150RG: 5'TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAC-3'；rs7971150RA: 5'-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAT-3'；rs7971150RP: 5'-GATTACATTAGAAAGAATGCTCTAGCAGATAACA-3'。

1.2.2 动脉血气测定 采用美国Nova Stat Profile M 型血气生化分析仪(电极法) 测定患者动脉血气。

1.2.3 肺功能测定 应用意大利生产的COSMED 肺功能仪测定肺功能，记录患者FEV1、FEV1%等结果。

1.2.4 6 分钟步行距离的测定 在病房内用米尺事先测定30 米距离，标明起始点位置，每5 米标注数字，记录患者6 分钟所行走的距离。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示，组间两两比较采用LSD-t检验。以Hardy-Weinberg 平衡定律评估样本的群体代表性（值>0.05 有意义）。应用直接计数法统计各位点的基因型频率与等位基因频率（%），基因型频率、等位基因频率的对比采用检验。用logistic 回归方法计算优势比（odds ratio，OR）及其95%置信区间（confidence interval，CI）。<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 本研究共纳入AECOPD 患者150 例，非COPD 患者150 例（包括支气管扩张急性加重患者80例、社区获得性肺炎患者70 例）。经Hardy-Weinberg平衡检验，rs7971150 位点的基因型在2 组间分布符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性（P 值为0.696，>0.05 有意义）。本研究rs7971150 位点的基因型分为野生型（AA）、变异杂合子（GA）、变异纯合子（GG）。

2.2 2 组rs7971150 位点基因型频率分析2 组rs7971150位点基因型频率分布的差异有统计学意义(<0.05);与AA 基因型相比较，GG 基因型显著增加了患病风险（OR=2.52，=0.0076）。见表1。

表1 2 组rs7971150 位点基因型频率分析

2.3 2 组rs7971150 位点基因型的亚组分析 在吸烟亚组和不吸烟亚组中，rs7971150 位点基因型频率在观察组与对照组之间分布的差异均有统计学意义(<0.05)，且在吸烟亚组中，与AA 基因型相比较，GA、GG 基因型都显著增加了患病风险（OR=2.16,=0.027；OR=3.21，=0.009）。见表2。

表2 2 组rs7971150 位点基因型的亚组分析

2.4 2 组有关指标的比较 如表3所示，与对照组不吸烟患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离等有关数据相比，对照组吸烟患者上述指标之间的差异均无统计学意义（均>0.05）。

表3 2 组有关指标的比较

与观察组不吸烟患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离等有关数据相比，观察组吸烟患者pH 值、PaO2、PaCO2之间的差异均无统计学意义(均>0.05)，而观察组吸烟患者FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离之间的差异均有统计学意义(均<0.05)。

与对照组（不吸烟、吸烟）患者相比，观察组患者pH 值、PaO2之间的差异均无统计学意义(均>0.05)；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离之间的差异均有统计学意义(均<0.05)。

3 讨论

测定基因多态性在阐明人体对疾病的易感性与耐受性、疾病表现的多样性起着非常重要的作用。研究提示COPD 人群易感性与基因多态性之间存在某种联系[4]。白三烯刺激白细胞趋化、聚集、释放氧自由基及溶酶体酶，可增加血管壁通透性，刺激支气管平滑肌细胞分泌粘液，从而引起支气管平滑肌收缩，与COPD 的发病机制密切相关[3]。在COPD 发病和疾病进展中，LTA4H 存在高表达。香烟烟雾可诱导气道上皮细胞LTA4H 的表达[7]，因此LTA4H 基因多态性与香烟烟雾暴露之间存在基因与环境之间的相互作用。长期香烟烟雾刺激不仅引起气道的慢性炎症，还能导致气道上皮细胞增生与凋亡失衡[13]。

本研究显示：在观察组与对照组之间，rs7971150位点基因型频率分布的差异有统计学意义，与AA 基因型相比较，GG 基因型显著增加了患病风险。在吸烟亚组和不吸烟亚组中，rs7971150 位点基因型频率在观察组与对照组之间分布差异均有统计学意义，且在吸烟亚组中，与AA 基因型相比较，GA、GG 基因型显著增加了患病风险。与观察组不吸烟患者相比，观察组吸烟患者pH 值、PaO2、PaCO2之间的差异均无统计学意义，而FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离之间的差异均有统计学意义。与对照组（不吸烟、吸烟）患者相比，观察组患者pH 值、PaO2之间的差异均无统计学意义；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分钟步行距离之间的差异均有统计学意义。以上研究结果说明：通过LTA4H 基因多态性rs7971150 位点测定，GA 基因型、GG 基因型显著增加了COPD 患病风险，GA基因型、GG 基因型突变与COPD 患者发病有关。吸烟的COPD 患者存在明显的GA、GG 突变基因型，吸烟是导致吸烟者发生COPD 的重要原因，与不吸烟的COPD 患者相比，吸烟的COPD 患者存在更差的肺功能、更短的6 分钟步行距离。

综上所述，通过LTA4H 基因多态性rs7971150 位点测定，GA 基因型、GG 基因型显著增加了COPD患病风险。吸烟的COPD 患者存在明显的GA、GG突变基因型，以及较差的肺功能、较短的6 分钟步行距离。本研究不足之处是小样本、单中心研究，以后要进行大样本、多中心的临床研究，为以后在临床上从基因层面测定患者外周血rs7971150 位点基因多态性，配合肺功能早期筛查、早期确诊COPD 提供科学依据。