高效液相色谱法测定清热解毒颗粒中盐酸小檗碱的含量

万勇，杨毅生，付志文，周志强，洪挺

1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；3.江西康恩贝中药股份有限公司，江西 上饶 334400

清热解毒颗粒是由金银花、连翘、黄连、知母、石膏、水牛角、玄参、地黄、大青叶等九味中药材组成，具有清热解毒，养阴生津，泻火等功效。临床最早用于轻、中型乙型脑炎，后来发现其具有良好的治疗风热型感冒、流行性腮腺炎的作用［1］。方中金银花、连翘疏散风热，清热解毒，为君药；石膏、知母、黄连清热泻火解毒，为臣药；水牛角、大青叶、地黄、玄参清热凉血，合为佐药；全方共奏清热解毒的作用。

《中国药典》2015 年版一部中收载的清热解毒片和清热解毒口服液［2］，以及其他两个清热解毒颗粒医院制剂［3-5］处方药味组成均同本课题清热解毒颗粒不同，属于同名异方。本研究的清热解毒颗粒现行质量标准为中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十三册（WS3-B-2618-97），标准正文只收载了［性状］、［鉴别］（1）理化鉴别皂苷类化学成分、［鉴别］（2）理化鉴别处方中石膏、［鉴别］（3）显微鉴别处方中黄连的盐酸小檗碱、［检查］项。现行标准简单，质量控制研究文献相对较少［6-8］，且通过显微鉴别黄连中盐酸小檗碱方法落后，干扰较大、难于观察，故本研究采用HPLC 法测定其盐酸小檗碱的含量，以期为清热解毒颗粒质量标准控制提供参考。

1 仪器与试剂

安捷伦1260 高效液相色谱仪（含OpenLab CDS色谱工作站，四元泵、自动进样器和DAD 检测器）、Sartorius BSA124S-CW 型电子天平（德国赛托利斯公司），TE212-L 型十万分之一天平（德国赛托利斯公司）。

盐酸小檗碱对照品（批号：120913-201310，含量以86.8% 计），购自于中国食品药品检定研究院。乙腈为购于Sigma 公司（色谱纯），其他均为分析纯。清热解毒颗粒共15 批次，分别为A 公司3 批171201、171202、171203，B 公司1 批，批号为171201，C 公司3 批，批号分别为17430502、17430503、17430504，D 公司5 批，批号分别为161002、170501、170502、171001（无蔗糖）、170501（无蔗糖）；E 公司3 批均为无蔗糖型，批号分别为20170901、20170902、20170302。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称定盐酸小檗碱对照品适量，加50%甲醇-盐酸（100∶1）溶解成每毫升含盐酸小檗碱0.04 mg的对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取装量差异下的清热解毒颗粒适量，研细，精密称取2 g，然后加入50 mL 烧瓶中，再精密加入50%甲醇-盐酸（100∶1）25 mL，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷后再称定重量，加溶剂补足损失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。

2.3 阴性对照溶液的制备

取处方中缺黄连的其它药材，照清热解毒颗粒生产工艺制备阴性样品，再按“2.2”项方法制成阴性对照溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱：SunFire C18 柱（4.6×250 mm，5 μm），以乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（22∶78）为流动相；流速为 1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为346 nm，进样量：5 μL。依照上述色谱条件进行测定，结果色谱图中显示其他化学成分对盐酸小檗碱色谱峰无干扰［9-12］，分离度良好。理论塔板数按盐酸小檗碱色谱峰计应不低于3 000。对照品及供试品色谱图见图1。

图1 清热解毒颗粒对照品（A）、供试品（B）和阴性（C）色谱图

2.5 线性关系的考察

精密称取盐酸小檗碱对照品11.40 mg(含量为86.8%)，置100 mL量瓶中，加50%甲醇-盐酸（100∶1）溶液溶解至刻度，作为对照品母液，精密量取上述母液1 mL 至50 mL 量瓶中，加50%甲醇-盐酸（100∶1）溶液至刻度，作为对照品稀释液①；精密量取上述母液2 mL 至50 mL 量瓶中，加50%甲醇-盐酸（100∶1）溶液至刻度，作为对照品稀释液②。精密吸取上述对照品稀释液①2 μL、5 μL、10 μL，对照品稀释液②10 μL，对照品母液2 μL、5 μL，进入HPLC 色谱仪，测定峰面积，以峰面积A 为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，盐酸小檗碱回归方程为Y=4 003.322 0X+2.035 6，R2=0.999 9，盐酸小檗碱在0.003 958～0.494 8 μg 之间具有较好线性。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，注入HPLC 色谱仪，连续测定6 次，结果对照品峰面积RSD 为0.5%，表明仪器具有较好的精密度。

2.7 重现性试验

取本品（A 公司，批号：171202）6 份，依法制备供试品溶液，进行测定，结果供试品溶液中盐酸小檗碱含量平均值为0.035 mg/g，RSD 为1.3%，实验表明该方法具有较好的重现性。

2.8 稳定性试验

取本品（A 公司，批号：171202）样品一份，依法制备供试品溶液，分别在1，2，3，6，9，12，24 h 注入HPLC 色谱仪，计算结果显示盐酸小檗碱峰面积的RSD 为1.1%（n=7），说明盐酸小檗碱在24 h 内具有良好的稳定性。

2.9 回收率试验

称取已知盐酸小檗碱含量的本品（A 公司，批号：171202，含盐酸小檗碱0.035 mg/g）适量，碾磨成粉末，精密称取1 g，置50 mL 三角瓶中，精密加入盐酸小檗碱对照品溶液（盐酸小檗碱对照品：0.001 187 mg/mL）25 mL，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，冷却，再称定重量，加50%甲醇-盐酸（100∶1)补足损失的重量，摇匀，离心，取上清液，即得。按正文中［含量测定］项下方法试验，计算回收率，结果见表1。

2.10 耐用性试验

取本品，分别用（1）SunFire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；（2）Diamonsil-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；（3）ACES-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 种品牌的色谱柱进行实验，测定结果RSD 为1.6%，表明该方法具有较好耐用性。

2.11 样品测定

分别取供试品15 批次，按“2.2”项下供试品制备方法制备，每批平行处理2 份，每份进2 针，以平均峰面积计算盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

表1 盐酸小檗碱回收率试验结果（n=6）

表2 盐酸小檗碱含量测定试验结果（n=6）

3 讨论

清热解毒颗粒成分复杂，化学成分丰富，为防止其他组分对盐酸小檗碱色谱峰的干扰，采用DAD检测器对对照品和样品进行扫描，结果盐酸小檗碱色谱峰在346 nm 处有最大吸收，且未被其他杂峰干扰。对建立的含量测定进行方法学考察：考察了不同提取方式，结果显示加热回流与超声提取效率相似。考察了甲醇、50%甲醇、50%甲醇-盐酸（100∶1）溶液为提取溶剂，结果显示50%甲醇-盐酸（100∶1）溶液为溶剂提取最完全。考察了超声10、20、30、50 min，结果显示超声30 min已全部提取完全。研究还对流动相进行考察，摸索乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈（甲醇）-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液不同比例作为流动相，结果盐酸小檗碱在乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（13∶87）为流动相，峰型最佳，分离度最好。

研究对不同企业15 批次清热解毒颗粒进行盐酸小檗碱含量进行测定，结果不同企业其含量差异较大，同企业样品差异较小，表明同企业生产工艺较为稳定，不同企业使用黄连药材质量差异较大。