高产活性成分蛹虫草菌株的筛选

柯轶，王娜，魏瑜，周昀，余宝珍，张贵和，陈玉舜

摘要：对7株不同的蛹虫草菌株进行比较分析，以期筛选得到高产活性成分的优质蛹虫草菌株。通过对7株蛹虫草菌株子实体的形态、产量、子实体中活性成分（虫草素、虫草酸、腺苷、虫草粗多糖）的含量等进行对比研究。结果表明，菌株H05综合品质最好，子实体产量可达204 g·瓶-1，虫草素含量为0523%、腺苷含量为0556%、虫草酸含量为497%，虫草粗多糖含量为989%。此菌株子实体产量高，活性成分含量也较高，经济价值高，值得开发利用。

关键词：蛹虫草;子实体;活性成分;高含量

中图分类号：S 5673 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）02-0014-05

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102003

Screening of Cordyceps Militaris Strains Produced Highyield Active Ingredients

KE Yi1， WANG Na1， WEI Yu1， ZHOU Yun1， YU Baozhen2， ZHANG Guihe2， CHEN Yushun3

（1. Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350008， China; 2. Fuzhou Huisheng Edible

Fungi Co.， Ltd.， Fuzhou， Fujian 350008， China; 3. HUNGKUANG University， Taichung， Taiwan 43302， China）

Abstract： Seven different strains of Cordyceps militaris were compared and analyzed in order to select the highquality strains of Cordyceps militaris with highyield active ingredients. The morphology， yield and content of active ingredients （cordycepin， cordycepic acid， adenosine and cordyceps crude polysaccharide） in the fruiting body of the seven strains of Cordyceps militaris were studied comparatively. The results showed that the strain H05 had the best comprehensive quality， and the yield of fruiting body was 20.4 g per bottle， the cordycepin content was 0.523%， adenosine content was 0.556%， cordycepic acid content was 4.97%， and the cordyceps crude polysaccharide content was 9.89%. The strain had high yield of fruiting body， high content of active ingredients and high economic value， and was worthy of development and utilization.

Key words： Cordyceps militaris; Fruiting body; Active ingredients; High content

蛹虫草Cordyceps militaris又称为北虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界的子囊菌们Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicip itaceae，是世界性广布种＼[1＼]。在我国的辽宁、福建、陕西、云南、台湾等地区均有分布＼[2-3＼]。通过对蛹虫草的化学成分和药理研究表明，其营养丰富，富含多种活性物质，如虫草素、虫草酸、腺苷、虫草多糖、氨基酸、麦角固醇、多酚等，具有镇静催眠、提高机体免疫力、抗肿瘤、防止衰老、保护心肺组织等多种药理作用＼[4-6＼]。文献报道蛹虫草的成分与天然的冬虫夏草十分相似，《全国中草药汇编》记载：“蛹虫草的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”，且药用活性成分平均含量如虫草素、氨基酸等，明显高于冬虫夏草＼[7-10＼]，这一特性，使得蛹虫草可以作为冬虫夏草的良好替代品。现今，蛹虫草已在全国各地实现了工业化栽培，具有广阔的产业化发展前景。但是菌种退化、产品质量标准缺失、精品缺乏等问题依然困扰着产业的发展。

蛹虫草的活性成分含量决定了蛹虫草的保健价值＼[11＼]。沈阳师范大学蛹虫草研究团队于2008年提出了功能性蛹虫草概念，重点围绕菌种、成分、評价和产品四个方向开展研究工作＼[12＼]。目前关于蛹虫草菌株筛选的研究，对综合子实体产量及多种活性成分含量的研究较少，更多集中于子实体的生长速度、产量以及形态等方面，对子实体中活性成分含量的研究仅集中于1～2种活性成分上，如多糖、虫草素等＼[13-22＼]。

本研究通过对7株不同的蛹虫草菌株进行了子实体栽培试验及4种活性成分（虫草素、虫草酸、腺苷、虫草粗多糖）检测，综合蛹虫草子实体形态、产量及4种活性成分含量作为评价指标，以期筛选得到具有高产活性成分的优良蛹虫草菌株，提升蛹虫草的开发价值，为蛹虫草产业的发展提供科学参考。

1材料与方法

11材料、试剂和仪器

柯轶等：高产活性成分蛹虫草菌株的筛选2021年第2期2021年第2期柯轶等：高产活性成分蛹虫草菌株的筛选111供试菌株蛹虫草菌株H01、H02、H03来自台湾弘光科技大学陈玉舜教授实验室，菌株H04来自福州惠生食用菌有限公司自有菌株，菌株H05、H06、H07来自福建生物工程职业技术学院柯轶老师实验室。

112主要试剂和仪器标准品腺苷、虫草素（3′脱氧腺苷）、D无水葡萄糖均来自中国食品药品鉴定研究院，纯度99%;试剂乙腈、磷酸二氢钾为色谱纯，磷酸钾、过碘酸钠、硫酸、硫代硫酸钠、碘化钾、VB1、VB2、硫酸镁为分析纯。

113主要设备LC2030 3D高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）、T6可见/紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

12培养基

液体种子培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 5 g、MgSO4 2 g、VB1 10 mg、VB2 5 mg、水1000 mL、pH 64 的比例配成液体种子培养基。

固体培养基：按土豆200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 2 g、MgSO4 1 g、VB2 5 mg、水1000 mL、琼脂20 g、pH 64的比例配成固体培养基。

大米栽培培养基：将大米和水按（1∶1～1∶11）的比例范圍加入透明的食品级玻璃瓶中，瓶口密封，每瓶大米装料量为35 g。

137株蛹虫草子实体的培养

131原种制作在无菌条件下将菌株接种至固体培养基平板活化，22℃黑暗培养。

132栽培种选择菌丝洁白无转色，长势旺盛的原种平板，在无菌条件下，取2～3块05 cm2的菌块接种到500 mL三角瓶中，装液量约为瓶容量的35%，22℃、150 r·min-1黑暗振荡培养5～7 d。

133人工栽培选取菌液澄清透明，菌丝呈球状、片状和丝状均匀分布，无异味，无杂菌的栽培种，在无菌条件下，以2 mL·瓶-1的接种量接入栽培瓶。接种后的培养基移入培养室，温度18～22℃，湿度60%～70%，避光培养17～20 d，待菌丝布满整个瓶面并深扎到瓶底，开始见光培养，光照强度控制在（200±50） lx，光照时间 （10±1）h·d-1，温度（20±2）℃，湿度65%～75%，培养至原基出现。调整光照时间为 8 h·d-1，温度（18±1）℃，湿度控制在85%～90%，培养45～50 d至子实体成熟并长满全瓶时收获，记录每瓶子实体产量及菌株形态。

14活性成分测定

样品经60℃烘至恒重后测定虫草粗多糖、虫草素、虫草酸、腺苷的含量。虫草粗多糖提取采用先醇提再水提的方法进行，含量测定采用苯酚硫酸法进行。虫草酸的检测采用滴定法进行检测。核苷类成分采用高效液相色谱法进行检测，其中虫草素的检测条件色谱柱为ZORBAX SBAq （250 mm×46 mm），流动相为乙腈∶水（10∶90），流速为1 mL·min-1，检测波长：260 nm，柱温：30℃，进样量：20 μL＼[23＼];腺苷的检测条件为，色谱柱：RP18e（250 mm×46 mm，merck），流动相：乙腈∶001 mol·t-1 NaHPO4（5∶95），流速：1 mL·min-1，检测波长：260 nm，柱温：30℃，进样量：20 μL＼[11＼];每个检测样品做3个平行试验。

15品质评价

为了便于不同单位、不同量级的指标能够进行比较和加权，利用最大-最小归一化算法处理＼[24＼]，Y=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）进行归一化处理，对7株蛹虫草菌株中活性成分含量及子实体产量进行分析。再综合各成分所得的分值，绘制雷达图，进行品质综合评价。

16数据处理

采用SPSS 170进行试验数据统计分析，计算平均值和标准差，并进行单因素Anova分析，以Duncan′s分析比较差异显著性。

2结果与分析

217株蛹虫草菌株人工栽培形态比较分析

从图1和表1可以看出，7株蛹虫草子实体中，菌株H05、H03的长势较好，粗细均匀，子实体长度较长，出草率高，菌株H01的长势最差，几乎不出草。

227株蛹虫草菌株子实体产量比较分析

在相同培养条件下栽培得到7个蛹虫草菌株子实体，针对菌株固体栽培生长情况进行产量测定。从表2可知，7株菌株的子实体产量存在极显著差异，说明，菌株是影响子实体产量的最重要因素。其中菌株H05的子实体产量最高，为（204±032） g·瓶-1，其次为菌株H03。

237株蛹虫草菌株活性成分含量比较分析

对相同培养条件下获得的7株蛹虫草菌株子实体中的腺苷、虫草素、虫草粗多糖、虫草酸等活性成分进行检测分析。从表3可知，7株蛹虫草菌株中的活性成分差别较大，各菌株间虫草素、腺苷、虫草酸、虫草粗多糖的含量均达到极显著差异（P<001），其中腺苷H05菌株的含量最高，H01菌株的含量最低;虫草素H05菌株的含量最高，H06菌株的含量最低;虫草粗多糖H06菌株含量最高，H02菌株的含量最低;虫草酸H06菌株的含量最高，H02菌株的含量最少。

247株蛹虫草菌株品质评价结果分析

从表3可以看出，H05菌株的腺苷、虫草素含量及子实体的产量最高，H06菌株的虫草粗多糖、虫草酸含量较高。对7株蛹虫草菌株中的活性成分的含量及子实体的产量进行归一化算法后，得分情况见表4。雷达图可以较为直观地反映出菌株中各组分的分布情况。利用对不同菌株各组分进行最大-最小归一化算法得出的具体分值作图3，从图3可知，菌株H05的各组分分布较为均匀，说明其综合品质较高，且组分都处于较高水平。

3讨论与结论

范志微＼[19＼]对14株野生蛹虫草菌株进行人工栽培子实体生长状况筛选试验;吴宪等＼[20＼]对6株蛹虫草菌株进行子实体栽培及虫草素和多糖含量进行检测，筛选获得的优质菌株中，虫草素的含量最高可达046%;于海洋等＼[21＼]对8株蛹虫草菌株的菌丝生长速度、菌落平均直径、液体发酵菌丝体干重、培养周期以及子实体形态、重量、粗多糖含量的对比研究，筛选优良蛹虫草菌株;张俊等＼[22＼]用4个蓖麻蚕品种的5龄4 d幼虫和4株蛹虫草菌Cordyceps militaris菌株培育蚕蛹虫草，以蓖麻蚕感染僵化率、出草率以及蚕蛹虫草中腺苷、虫草素、喷司他丁含量为指标，筛选最佳配对蓖麻蚕品种及蛹虫草菌株，其虫草素含量为148～194 mg·g-1、腺苷含量为069～082 mg·g-1;朱丽娜等＼[24＼]对市售的16株蛹虫草子实体样本中的活性成分进行研究，发现市售样品中，各活性组分含量具有极大差异，虫草素含量平均值为032%，最高为037%，多糖含量平均为304%，最高为48%，腺苷含量平均为0153%，最高为019%。先前的关于蛹虫草菌株选育的研究大多数集中于对菌株的菌丝、子实体生长方面，对活性成分的研究相对较少，且大多数研究结果活性成分的含量低于本次筛选得到的菌株。

本研究通过对闽台两岸7株不同来源的蛹虫草菌株中虫草素、虫草粗多糖、腺苷、虫草酸的含量进行检测，综合菌株人工栽培情况，筛选出H05菌株为较为优质的菌株，其子实体中腺苷量可达0556%，虫草素含量可达0523%，虫草粗多糖含量可达989%，虫草酸含量可达497%，平均子实体产量可达204 g·瓶-1。

但本研究仅对蛹虫草菌株进行了简单的筛选，采用的是常规的培养方法，并未对培养条件进行优化，也未对菌株进行遗传稳定性的研究，不能保证菌株的优良特性能得以延续。因此如果想要获得更高的活性成分含量，还需进一步的研究，优化培养条件及培养基配方，并对菌株的遗传稳定性进行研究，获得稳定高产的菌株。

参考文献：

[1]杨益广，黄作喜蛹虫草人工培养研究进展[J]安徽农学通报，2019，25（14）：21-24

[2]CHINGPENGCHIUA，TSONGLONGHWANG，et al.Research and development of Cordyceps in Taiwan[J].Food Science and Human Wellness，2016（5）：177-185

[3]文庭池，查岭生，康冀川，等蛹虫草研究和开发过程中的一些问题和展望[J]菌物学报，2017，36（1）：14-27

[4]涂俊铭，王碧，夏险蛹虫草生物活性成分及药理作用研究进展[J]食用菌，2020，42（6）：4-7

[5]樊慧婷，林洪生蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J]中国中药杂志，2013，38（15）：2549-2552

[6]卢丽丽蛹虫草活性组分的提取及其抗肿瘤效果的研究[D]杭州：浙江理工大学，2012

[7]周苏冬虫夏草及虫草制品中活性成分检测方法的建立及含量测定[D]上海：上海海洋大学，2013

[8]艾中，钱正明，李文佳，等冬虫夏草核苷类成分分析研究进展[J]菌物学报，2016，35（4）：388-403

[9]周苏冬虫夏草及虫草制品中活性成分检测方法的建立及含量测定[D]上海：上海海洋大学，2013

[10]钟石，李有贵，陈诗，等人工培养蛹虫草与冬虫夏草的主要活性成分比较[J]蚕业科学，2009，35（4）：831-836

[11]张瑞华蛹虫草在保健食品中的应用[J]齐鲁工业大学学报，2020，34（3）：17-20

[12]張鑫喆，徐方旭，柳叶飞，等不同来源多种虫草核苷类物质检测分析比较[J]生物化工，2019，5（1）：98-102

[13]唐贤华，张崇军，隋明，等 高产虫草酸蛹虫草菌株的分离鉴定及培养条件优化[J]中国酿造，2019，38（11）：134-139

[14]曹莉蛹虫草菌种分离及保藏方法对蛹虫草生长发育及生物活性成分积累的影响[D] 呼和浩特：内蒙古农业大学，2020

[15]柴林山，冯敏，徐冲，等野生蛹虫草菌株培养特性及子实体多糖含量比较分析[J]微生物学杂志，2020，40（4）：78-83

[16]王惠高产子实体蛹虫草菌株的选育[D]长沙：中南林业科技大学，2015

[17]曹照平高产蛹虫草菌株的诱变选育及其积累虫草素的研究[D]大连：大连工业大学，2014

[18]王蕾，罗巍，胡瑕，等虫草素高产菌株的筛选及不同添加物对虫草素产量的影响研究[J]菌物学报，2012，31（3）：382-388

[19]范志微蛹虫草优良菌株的筛选及其营养特性的分析[D]哈尔滨：东北林业大学，2013

[20]吴宪，张国财，张杰，等蛹虫草菌株的栽培与筛选[J]中国林副特产，2013（3）：6-8

[21]于海洋，王延锋，史磊，等蛹虫草优良菌株的筛选[J]中国食用菌，2017，36（5）：17-20

[22]张俊，张晓，颜新培，等适合培育蚕蛹虫草的蓖麻蚕品种和蛹虫草菌株筛选试验[J]蚕业科学，2019，45（6）：862-869

[23]张丽艳，张春梅，张凤梅，等虫草素水提取工艺的研究[J]安徽农学通报（上半月刊），2010，16（7）：31-33

[24]朱丽娜，刘艳芳，张红霞，等不同来源的蛹虫草子实体活性成分的比较[J]菌物学报，2018，37（12）：1695-1706

（责任编辑：柯文辉）

柯轶，王娜，魏瑜，等高产活性成分蛹虫草菌株的筛选＼[J＼]福建农业科技，2021，51（2）：14-18.

收稿日期：2021-01-12

作者简介：柯轶，女，1986年生，讲师，主要从事食用菌栽培、食品微生物学应用方向研究。

基金项目：福州市农业科技星火项目（2019-N-18）;福建省中青年教师教育科研项目（JAT171014）。