石油污染对场地中细菌群落的影响及其反馈机制

郑一鸣， 何小松， 单光春,2， 崔 骏， 虞敏达， 赵航正,4， 席北斗*

1.中国环境科学研究院， 国家环境保护地下水污染模拟与防控重点实验室， 北京 100012 2.哈尔滨工业大学环境学院， 黑龙江 哈尔滨 150090 3.中国环境科学研究院固体废物污染控制技术研究所， 北京 100012 4.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院， 北京 100083

石油污染改变了土壤和地下水中微生物群落的组成与结构[1-2]. 在污染场地中，石油分布不均[3]，不同污染特征中的细菌群落分布与组成差异性较大[4]. 随着分子生物学和高通量测序技术的发展，微生物组学的研究越来越深入[5]. Baas-Becking[6]认为“万物无处不在，但环境选择一切”. 不同生存环境下，确定性过程与随机性过程发挥着不同的作用[7-8]. 传统上，人们认为环境选择等确定性过程决定了群落组装过程[9]. 例如，生态位理论认为，生物和非生物因素对环境中细菌群落的相对丰度有重要影响，甚至影响某一物种的生存与否[10]. 其中，pH是确定性过程中对细菌群落结构影响的主要驱动力[11-12]. 地理距离、土壤有机质以及无机盐离子也会对细菌群落分布产生重要影响[3,12]. 环境压力和物种性状在确定性过程中起着至关重要的作用[13]. 当外界干扰较小时，环境中细菌群落的演替方向变化也较小，当外界持续不断干扰时，外源微生物入侵，可能会导致土著细菌群落结构变化，改变其演替方向[14]. 确定性过程会在不同尺度上影响群落的组装[15]. 然而现有研究也发现，随机性过程在某些群落组装的过程中起主导作用[16-17]. 例如，中性理论认为，微生物的繁殖、迁移、死亡过程影响了随机性过程[18]，并不是环境选择而是微生物演替的随机性影响了细菌物种相对丰度的变化[19]. 中性理论假设物种在生态位上都是等效的，随机的出生、死亡、漂移以及物种的生成与灭绝等随机性因素影响了微生物的群落结构. 已有研究证明，确定性过程和随机性过程皆会对群落组装产生重大影响[20]，但是在不同污染特征中其重要性存在差异[21-22]. 在高多样性的环境中，随机性过程占主导地位；而在多样性低的环境中，确定性过程占主导地位[23]. 理解微群落组装过程的基本生态机制是群落生态学尤其是微生物群落生态学的一大挑战. 判断确定性过程与随机性过程在污染场地细菌群落组装中发挥的作用对于理解污染生态学具有非常重要的意义. 目前对于石油污染场地中细菌群落特征的研究较少，且主要集中在石油污染对细菌群落多样性的影响方面，然而在不同石油污染特征下细菌群落结构的变化与群落组装机制仍不明确.

该研究选择7个受石油污染程度不同的土壤样品和2个受石油污染含水层沉积物样品，采用荧光定量PCR(qPCR)和DNA高通量测序技术，分析了好氧与厌氧特征降解基因拷贝数和细菌群落多样性差异，评估了不同石油污染生境对细菌群落多样性的影响，分析了细菌对石油污染的反馈过程，揭示不同石油污染环境下细菌群落多样性与污染特征的关系，进而明确不同污染生境细菌群落组装的机制.

1 材料与方法

1.1 试验场地与样品采集

如图1所示，样品采集于甘肃省某石化场地，它是我国西北地区石化场地的典型代表，场地中存在油泥堆积区域，部分区域土壤污染严重.

图1 采样点分布Fig.1 Distribution of the sampling sites

于2019年12月选择3个不同污染程度的区域表层(0～3 cm)采集石油污染固态样品，分别为油泥堆积区域(A)、石油污染土壤区域(B)和未污染土壤区域(C)，以上3种环境均可认为是好氧环境；同时，对发生石油泄漏污染地下水的区域进行钻井，获得含水层沉积物样品(D)，可认为是厌氧环境. 样品信息见表1. 在油泥区域采集2个样品，分别标记为S1和S2；石油污染土壤区域采集2个样品，分别标记为S3和S4；在未污染土壤区域采集3个样品，分别标记为S5、S6和S7；含水层沉积物样品选择2个井的沉积物；分别标记为S8和S9.

土壤样品采集方法：在1 m2区域内，随机选择3～5个采样点，用无菌铲迅速采集表层(0～3 cm)土壤500 g放入塑封袋中密封低温保存. 含水层沉积物样品采集方法：在场地开凿钻孔，将含水层沉积物样品去除泥皮，采集饱和含水层岩芯500 g，并用锡纸包裹放入密封袋中低温保存，尽量排出袋内空气. 所有样品一式两份，一份用于测试石油浓度，另一份用于测试细菌群落多样性. 石油浓度的测试根据LU等[23]所述的方法进行.

表1 受石油污染的土壤与沉积物样品的污染特征Table 1 Contamination characteristics of samples of petroleum-contaminated soils and sediments

1.2 荧光定量PCR

研究表明，alkB基因编码的烷烃单加氧酶和nah基因编码的萘双加氧酶是研究细菌群落在生物修复位点好氧降解石油潜力的理想标记[24-26]. 烷基琥珀酸合成酶(ASS)的编码基因ass被认为是厌氧体系中烷烃降解的唯一标志[27]. 也有研究表明，在厌氧环境中，大多数芳烃化合物都经过微生物作用，形成中间体6-十六氧环烯基-CoA. 该物质开环反应的关键酶是bamA基因编码的6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶[28]. 采用荧光定量PCR技术，测试了alkB、nah、ass、bamA与石油降解有关的特征基因拷贝数. 每个样品的4个基因均测试了6次，表2为各特征基因的引物名称及序列.

1.3 细菌群落多样性分析

用E.Z.N.A.®DNA Kit进行土壤微生物DNA样品提取，用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)两个引物对细菌16S rRNA基因的V4～V5区进行了PCR扩增.

表2 扩增特征基因所用的引物名称与引物序列Table 2 The primer name and primer sequences used to amplify characteristic genes

用含4 μL的5×fastpfu缓冲液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL 5 μmol/L引物、0.4 μL fastpfu聚合酶和10 ng模板DNA的混合物20 μL进行PCR反应. 用试剂盒提取扩增子在Illumina MiSeq平台测序. 原始fastq文件用QIIME进行质量过滤.

PCR反应参数：95 ℃持续3 min；95 ℃持续30 s，27 ℃持续30 s，72 ℃持续45 s，循环55次；72 ℃持续45 s，10 ℃直至停止.

2 结果与讨论

2.1 场地污染特征

油泥中的石油浓度较高，S1的石油浓度为 100 834 mg/kg，S2的石油浓度为 202 097 mg/kg. 油泥采样地点为储罐区，大量的石油产品长期泄露，导致该区域污染较为严重，成为油泥状；石油污染土壤次之，S3的石油浓度为 1 255.12 mg/kg，S4的石油浓度为321.7 mg/kg；在场地中的部分区域虽然不是污染源区，但是由于石油具有一定的挥发性和迁移性，导致部分迁移性较强的石油入侵未污染区域，造成污染范围扩大[29-30]；未污染土壤中也有极少量的石油，S5的石油浓度为0.13 mg/kg，S6的石油浓度为0.46 mg/kg，S7的石油浓度为0.34 mg/kg；含水层沉积物样品的石油浓度差异性较大，S8的石油浓度为58 mg/kg，S2的石油浓度为 2 028 mg/kg. 由于地下环境异质性较强，水文地质条件较复杂[31]，地下环境的异质性导致了不同含水层沉积物污染特征的差异性[32].

注： A—油泥；B—石油污染土壤；C—未污染土壤；D—石油污染沉积物. 下同.图2 不同污染特征的环境中4种降解基因的拷贝数Fig.2 Copies of four degradation genes in environments with different pollution characteristics

2.2 微生物降解基因与污染特征的关系

油泥、石油污染土壤和未污染土壤皆为好氧环境，而沉积物处于厌氧环境中. 图2为不同污染特征下4种具有降解石油功能的基因拷贝数. 由图2可见，油泥中alkB基因拷贝数(平均值为6.21×107copies/g)较高，石油污染土壤和未污染土壤中相对较少(平均值分别为1.38×107和1.88×107copies/g)，在受污染沉积物中最低(平均值为1.58×106copies/g)，较上述3种好氧环境下低了1个数量级. 油泥中，nah基因拷贝数较高(平均值为9.3×106copies/g)，可能是由于油泥中的高浓度石油促进了其增殖，nah基因拷贝数在石油污染土壤和未污染土壤中较少(平均值分别为9.94×105和3.37×105copies/g)，含水层受污染沉积物中nah基因拷贝数也较少(平均值为5.2×105copies/g).ass和bamA基因拷贝数在不同污染特征的环境中均较低，其中，ass基因拷贝数在油泥、石油污染土壤、未污染土壤和含水层沉积物中的平均值依次为1.99×105、2.11×105、8.86×105和9.43×103copies/g，bamA基因拷贝数则分别为3.51×107、5.08×107、8.84×107和4.86×106copies/g. 可见，在油泥、石油污染土壤和未污染土壤的好氧环境下，厌氧基因的增殖受到了限制. 在沉积物的厌氧环境下，厌氧基因拷贝数也较低，可能是由于在厌氧条件下很多微生物仅表现出石油的抗性，厌氧基因并不能有效增殖.

2.3 石油污染对场地中细菌群落多样性的影响

表3为7组土壤样品与2组含水层沉积物样品的微生物高通量测序结果，所有样品的物种覆盖度均超过98%，说明测序深度足够可以覆盖绝大部分物种.α-多样性可以反映环境中细菌群落的丰富度(Shannon-Wiener指数)、均匀度(Simpson指数)与多样性(Ace指数与Chao1指数)[33-34]. 该研究中，随着石油浓度的降低，土壤中细菌群落的Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Ace指数与Chao1指数均呈增加趋势. 不同污染特征的环境间细菌群落结构具有明显的差异性，不同污染特征的环境中细菌群落多样性与石油浓度呈显著负相关(P<0.05). 图3为不同污染程度下土壤和沉积物细菌群落之间的α-多样性组间差异，结果显示，未污染土壤与油泥之间细菌群落的α-多样性组间差异性极为显著(P<0.01)，未污染土壤与受污染沉积物之间的组间差异性也较为显著(P<0.05). 与未污染土壤相比，油泥和受污染沉积物中细菌群落的α-多样性降低了50%左右，而石油污染土壤中细菌群落的α-多样性降低了33%左右. 石油污染土壤与受污染沉积物中的石油浓度相近，二者的α-多样性也相近，氧气含量对α-多样性影响不大. 可见，高浓度石油污染是引起土壤和沉积物中微生物的群落组成变化的主要驱动因子，能够显著降低微生物群落的α-多样性，而氧气浓度并不是造成土壤与沉积物中微生物群落变化的主要驱动因子.

表3 9组土壤与沉积物样品的微生物高通量测序结果Table 3 Result of bacteria high-throughput sequencing in 9 samples of soil and sediments

图4 不同污染特征和不同浓度样品的细菌群落Venn图Fig.4 Venn diagram of bacteria community in different contaminated characteristic and different samples

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01.图3 不同污染特征的环境中α-多样性组间差异Fig.3 The difference of α-diversity in environments with different pollution characteristics

图5 9组样品属水平上细菌的相对丰度Fig.5 Relative abundance on genus level in 9 groups of samples

Venn图可以区分共享的和唯一的OTUs(Operational Taxonomic Units)[35-36]. 由图4可以看出，不同分组中油泥样品中的特异性物种最少，仅有45个OTUs；石油污染土壤次之，有292个OTUs；未污染土壤样品中的特异性物种最多，有 1 131 个OTUs；受污染沉积物中的特异性物种数量介于油泥和石油污染土壤之间，有124个OUTs. 油泥中石油含量最高，对土壤中微生物的毒害作用较大，导致其特异性物种数量降低[37]；石油污染土壤中含有几百至几千mg/kg浓度不等的石油，部分具有一定耐受性的物种可以在此环境中生存，其中微生物种群数量相对较高；未污染土壤中含有极少量的石油烃，远未达到对微生物的致死作用，部分具有降解能力的微生物还可以将土壤中的微生物解毒，使其转化为无毒无害的可利用有机物[38]，导致其中的微生物种群数量最多；对于沉积物中的微生物来说，由于其生活环境为厌氧，相对于好氧环境，微生物数量总体较少，所以其特异性物种主要为具有厌氧环境下利用石油烃作为碳源或能源的微生物. 由图4可以看出，在9组不同样品中都能够存活的细菌OTU数量为20，说明这20种微生物在不同浓度、不同氧气含量的环境下都能够生存，具有较强的环境适应性，但是这20种微生物是否具有石油降解能力仍然不明晰.

图5为属水平物种相对丰度，不同污染特征样品间有一定的差异性[39]. 其中，石油浓度较高的土壤和沉积物中Pseudomonas相对丰度均较高，石油浓度较高的土壤中Acidovoras相对丰度较低，石油浓度较低的土壤和未污染土壤中Pseudarthrobacter相对丰度均较高，Pseudoxanthomonas只在油泥中有检出，可能是较高的石油浓度选择出具有石油降解能力(或具有石油抗性)的微生物[40].Methylotenera只在含水层沉积物中被检测到，推测其与厌氧降解石油(厌氧石油抗性)有关，Spingomonas在油泥中未被检出，而在未污染土壤和受污染沉积物中存在，但是在受污染沉积物中其相对丰度较低，可以推断，这种微生物对石油的抗性较差，且在厌氧条件下活性较高.

注： 虚线表示确定性与随机性的分界限.图6 不同污染特征的环境中 细菌群落βNTI值Fig.6 βNTI diagram of bacteria community in environments with different pollution characteristics

2.4 细菌群落组装

为了量化确定性过程和随机性过程在石油污染场地细菌群落演替中的作用，该研究使用了加权丰度β-平均最近分类数值(βNTI)量化了群落组装之间的系统发育距离(见图6). βNTI<-2或βNTI>2表明确定性过程占主导地位；-2<βNTI<2表明随机性过程占主导地位；βNTI为2或-2，则不能判断群落组装过程[20]. 不同污染特征的环境在受到石油入侵后，细菌群落组装过程受到不同程度的影响. 油泥、石油污染土壤及未污染土壤等好氧环境下|βNTI|<2，表明细菌群落组装是随机性过程，受污染沉积物的厌氧环境下βNTI>2，细菌群落组装为确定性过程. 这表明石油在入侵土壤后，多样化过程和漂变过程占主导作用，而环境选择对细菌群落的影响较小[41]，导致细菌能够通过变异或者水平基因转移等方式获得新的表型并形成新的区系. 但是在受污染沉积物中，细菌群落组装主要受环境选择的影响[18]. 这说明含水层沉积物中可能存在部分物种有着独特的、与厌氧石油污染环境相适应的表型，使它们可以在厌氧石油污染下生存，而土壤环境中这类物种很少，可能是由于土壤环境不稳定，微生物演替未完成，细菌群落结构不仅受石油浓度的影响，而且还会受到其他环境因素的影响[42]. 好氧环境中，微生物的生态位在环境影响下会发生变化，石油对微生物的选择作用不是绝对的环境优势，在油泥、石油污染土壤中发现了大量不能降解石油的微生物类群存在，在未污染土壤中同样也发现了一些具有石油降解能力的微生物. 在厌氧环境中，环境相对封闭，与外界环境交流较少，石油浓度是有较大选择作用的环境因子，且含水层沉积物中细菌种类相对较少，群落稳定性较差，受到石油污染后，细菌群落迅速发生变化，其他环境因子的选择作用相对较小. 但是在沉积物中厌氧降解石油的基因含量较低，可以推测，在石油污染含水层沉积物后，大量微生物类群灭亡，造成了细菌群落的改变，而部分未死亡的微生物也不具有石油降解能力.

3 结论

a) 石油污染改变了庆阳石化老厂区中土壤和沉积物中细菌群落的丰富度、多样性及均匀度，细菌群落的α-多样性与石油浓度呈显著负相关(P<0.05). 高浓度的石油能够在好氧条件下促进alkB基因和nah基因的增殖.

b) 该场地土壤和沉积物中的细菌种群数量与石油浓度呈显著负相关(P<0.05)，污染场地不同污染特征的环境中细菌群落在门水平上具由较高的相似度，需要在属水平上加以区分. 污染源区与非污染源区土壤和沉积物之间的细菌群落结构差异性较大，不同浓度石油的毒性作用差异性较大，不同微生物对石油的耐受程度不同，环境的差异性也会导致细菌群落的差异性.

c) 在该石油污染场地的土壤中，土壤细菌群落组装中随机性过程占主导地位，含水层沉积物的细菌群落组装中确定性过程占主导地位. 土壤环境中具有好氧石油降解基因，而在沉积物中厌氧降解石油的基因含量较低，大部分微生物在石油污染发生后死亡，部分生存的微生物不具有石油降解能力，仅有抗性的表型，或者是处于休眠状态.