SPIN1通过调控上皮-间质转化促进胃癌细胞的迁移、浸润

吕蓓蓓，刘海亭，陈 旭，王亚文，宋 琳，高 鹏

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，最新研究数据显示其病死率位居第3位[1]。由于其症状隐匿，难以早期发现，胃癌患者确诊时多已为中晚期，5年生存率不足20%，严重危害国民的身体健康。浸润与转移是导致胃癌患者死亡的主要原因。目前关于胃癌浸润、转移的分子机制仍不明确。SPIN1又名Spindlin1，是SPIN/SSTY基因家族的主要成员，1997年Oh等[2]首次报道其为从卵母细胞向胚胎过渡过程中在小鼠中表达的主要母体转录物，在配子发生中发挥重要作用。此外其还是一种Tudor结构域蛋白，能够识别组蛋白H3第四位赖氨酸甲基化(H3K4me3)，通过与其结合从而影响表观遗传调控[3-4]。近年研究表明，SPIN1在多种人类恶性肿瘤如卵巢癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中高表达[5-7]，提示SPIN1可能是一个重要的癌基因，参与肿瘤的发生和发展。但迄今为止，SPIN1在胃癌中的表达水平、生物学功能和调控的分子机制仍不清楚，本文从细胞水平探究SPIN1对胃癌迁移、浸润的作用，并初步探究其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂本实验所用胃癌细胞株MKN45、BGC823、SGC7901、AGS及HGC27细胞购自中国科学院细胞库上海肿瘤研究所。细胞培养基(RPMI-1640)购自Invitrogen公司，胎牛血清FBS购自Gibco公司，胰蛋白酶、双抗、PBS干粉、DMSO购自索莱宝公司，细胞转染试剂Turbofect购自Thermo公司，细胞转染试剂X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent购自Roche公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，引物购自济南博尚公司，SPIN1抗体购自Proteintech公司(19531-1-AP)，vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug、Claudin-1和β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和转染 常规用RPMI-1640(Hyclone公司，USA)和10%胎牛血清(Gibco公司，USA)在37 ℃，5%CO2孵箱中培养。本课题组前期已构建SPIN1过表达质粒[7]，通过锐博公司人工合成靶向SPIN1的干扰序列(si-SPIN1)。然后将SPIN1过表达质粒和si-SPIN1及相应的对照分别转染至胃癌细胞株BGC823，使SPIN1表达上调/下调。质粒转染时选用Turbofect转染试剂，siRNA及对照转染选用X-tremeGENE转染试剂。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR检测 (1)培养箱取出细胞后弃去培养基，用PBS清洗3次，根据贴壁细胞的数量酌情加入适量的Trizol裂解细胞；根据试剂盒说明书的步骤提取细胞内总RNA，然后使用反转录试剂盒(TOYOBO)将RNA反转录为cDNA，后续进行qPCR验证。(2)使用Roche Universal SYBR Green Master进行实时荧光定量PCR检测，10 μL反应体系：SYBR Green(2×)5 μL，F primer(30 μm)0.1 μL，R primer(30 μm)0.1 μL，cDNA 1 μg，Nuclease-Free Water补足10 μL。(3)反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，合计40个循环。(4)结果分析：选用GAPDH为内参，每个样本的Ct值为2个复孔的Ct平均值，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，以相对表达量=2-△Ct计算。

1.2.3Western blot法 分别收集实验组和对照组的细胞沉渣，然后加入混合好的RIPA裂解混合液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，摇床孵育30 min(置于冰上)。孵育结束后4 ℃离心25 min(12 000 r/min)。收集上清液于新的EP管中。检测总蛋白浓度，然后将每个样品及蛋白marker上样至10%SDS-PAGE凝胶电泳，电泳2 h之后转膜至PVDF膜，采用5%封闭液(40 mL TBST+2 g奶粉)封闭2 h，洗膜后将膜放于一抗4 ℃摇床孵育过夜，再次洗膜后放于二抗(1 ∶5 000稀释)室温孵育1 h，最后滴加显影液显影、拍照。

1.2.4Transwell实验 (1)迁移实验：培养箱取出转染24 h后的胃癌细胞，胰酶消化后计数，实验组和对照组各取5×104个细胞用200 μL无血清培养基悬浮后加入普通Transwell小室内，沿小室外孔加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，孵箱内孵育24 h后观察结果。(2)浸润实验：Transwell小室内提前均匀加入稀释好的基质胶(培养基 ∶基质胶=4 ∶1)，凝固后即可使用。其余步骤与细胞迁移实验的操作步骤相同，细胞数增加至8×104个。(3)24 h后，将小室内的培养基吸出，用棉签小心擦净小室内膜面未穿出的细胞。将小室置于800 μL 4%多聚甲醛中，固定穿出外膜的细胞20 min，然后用结晶紫溶液染色15 min，小心用双蒸水冲洗、棉签擦净，显微镜下拍照计数。(4)分析结果：在倒置显微镜下，实验组及对照组随机选取3个视野分别计数穿过小室的细胞数，计算其平均值，然后进行统计分析。

1.3 统计学分析使用GraphPad Prism 5及SPSS 20.0软件进行统计学分析，使用t检验分析两组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5种胃癌细胞系中SPIN1的表达量通过qRT-PCR检测5种胃癌细胞系中SPIN1的相对表达量，结果显示在胃癌细胞系中，SPIN1在转移性胃癌细胞系SGC7901中的表达量最高，在HGC27的表达量最低(图1A)。

2.2 转染SPIN1质粒及si-SPIN1后BGC823中SPIN1的表达量在胃癌细胞系BGC823中转染SPIN1质粒后，与转染PCDNA 3.1的对照组相比，SPIN1的表达量明显升高(图1B)，转染si-SPIN1后，与对照组相比，SPIN1的表达量明显降低(图1C)。

图1 SPIN1在5种胃癌细胞系中的表达及BGC823细胞中过表达及干扰效率验证：A.各胃癌细胞系中SPIN1的表达；B.转染SPIN1后BGC823细胞中SPIN1的表达变化，***P<0.001；C.转染si-SPIN1后BGC823细胞中SPIN1的表达变化，**P<0.01

2.3 SPIN1表达对胃癌细胞BGC823迁移及浸润能力的影响Transwell实验结果表明，过表达SPIN1后，BGC823细胞穿透Transwell小室底滤膜的细胞数比对照组明显增多(P<0.05)，提示迁移、浸润能力增强。而相比于对照组，si-SPIN1组中BGC823细胞穿透Transwell小室底滤膜的细胞数明显减少(P<0.05，图2)，提示细胞迁移及浸润能力降低。

ASPIN1PCDNA3.1迁移浸润Bsi-SPIN1NC迁移浸润

2.4 SPIN1对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的调控作用通过Western blot法检测过表达/沉默SPIN1后BGC823细胞中EMT相关蛋白vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug及Claudin-1的表达水平变化。结果表明，与对照组相比，过表达SPIN1后Slug表达上调，Claudin-1表达下调；干扰SPIN1后Slug表达下调，Claudin-1表达上调，其余蛋白未见明显变化(图3)。

图3 过表达及干扰SPIN1后对EMT相关蛋白Slug及Claudin1表达的影响：A.过表达SPIN1；B.干扰SPIN1

3 讨论

胃癌是导致中国癌症死亡的主要原因之一，尽管化疗是中晚期胃癌患者主要的治疗手段，可适当延长患者总生存期，但化疗的不良反应突出，且易导致耐药。随着对胃癌发生、发展分子机制的深入研究，胃癌的分子靶向治疗越来越受到临床的关注。目前针对胃癌的靶点主要包括EGFR、HER-2、VEGF、VEGFR、mTOc-MET、HGF等，除应用曲妥珠单抗使得少数HER-2阳性晚期胃癌患者部分获益外，其他靶向药物的临床疗效不尽人意。因此，寻找在胃癌发生、发展中敏感和特异的基因改变，并研究其发挥作用的分子机制，对胃癌的临床诊治及提供抗癌药物的新靶点等方面均具有重要的理论和实际意义。

越来越多的证据表明，SPIN1是个新颖的癌基因，在肿瘤的发生、发展中起重要作用[5-6,8-9]，但在胃癌中尚未见相关研究。本实验首先在细胞水平验证了SPIN1在胃癌细胞系中高表达，且在淋巴结转移细胞系SGC7901中表达量最高，结果提示SPIN1可能与胃癌的浸润、转移密切相关。转移和浸润是恶性肿瘤的基本特征，胃癌的远处转移和浸润深度是影响患者预后的重要因素。后续我们将在临床样本水平进一步探究SPIN1表达与胃癌患者预后的关系。接下来为了明确SPIN1在胃癌迁移、浸润中的作用，本实验以BGC823细胞为研究对象进行了Transwell实验。结果表明过表达SPIN1可以促进胃癌细胞的迁移、浸润，而沉默SPIN1表达可以抑制胃癌细胞的迁移、浸润，进一步验证了SPIN1在胃癌浸润、转移中发挥重要作用。

目前对SPIN1发挥促癌作用的分子机制研究尚在初始阶段，下游只有少数靶基因被报道，更为广泛的分子调控机制仍待研究。EMT是肿瘤侵袭、转移的重要机制之一，在胃癌的浸润、转移中发挥重要作用[10]。肿瘤细胞通过发生EMT，失去上皮极性而获得间质特性，主要表现为细胞黏附分子如E-cadherin、Zo-1等表达减少，而vimentin、纤维结合蛋白等细胞骨架蛋白表达上调，同时与EMT相关转录因子Snail家族表达异常增加等[11]。Slug是Snail锌指家族的转录因子之一，是EMT的重要标志物，在多种恶性肿瘤中表达升高[12]，且与胃癌的不良预后密切相关[13]。本实验结果表明，在胃癌细胞系BGC823细胞中过表达/沉默SPIN1可以上调/下调Slug的表达，提示SPIN1可能通过调控Slug表达促进EMT进程。Claudin-1是紧密连接蛋白Claudins家族的成员之一，是重要的细胞间连接蛋白，与EMT的发生密切相关，研究发现Claudin-1在胃癌组织中表达明显降低，具有抑制胃癌细胞生长、侵袭和转移的功能[14]。本实验结果显示，SPIN1过表达可以抑制Claudin-1表达，而沉默SPIN1可以上调Claudin-1表达，表明SPIN1参与调控Claudin-1的表达。Martinez-Estrada等[15]研究发现Claudin-1是上皮细胞中Snail家族因子的直接下游靶基因。因此我们推测SPIN1对Claudin-1的调控作用可能是通过Slug实现的。在后续的研究中我们将继续深入研究这一分子机制。

综上所述，本实验选用胃癌BGC823细胞为研究对象，初步探讨了SPIN1在胃癌迁移、浸润中的作用及其对EMT的调控作用，为胃癌的发生、发展及转移评估提供了新的标志物，其更深入的分子机制有待进一步探索。