分子标记辅助选育甘蓝型油菜抗草甘膦除草剂恢复系

史慧芹，肖 麓

(青海大学，青海省农林科学院，青海省春油菜遗传改良重点实验室，国家油菜改良中心，青海分中心农业部春油菜科学观测实验站，青海省春油菜研究开发中心，青海 西宁 810016)

油菜是中国重要的油料作物，是油脂、蛋白质饲料及工业原料来源之一，具有生长适应性强、用途广、经济价值高等特点[1]。由于油菜栽培方式的变化与除草剂的广泛使用，导致油菜田间杂草问题日趋严重[2]。据报道，我国每年有50%～80%的油菜种植面积发生杂草危害，可造成15%～20%的产量损失[3]。田间除草方式分为劳动力成本高的人工中耕除草和快速高效防控草害的化学除草剂除草[4]。但由于种植田经常出现单子叶与双子叶类杂草混生，对除草剂的剂量及喷施时间的把控要求严格，难以达到预期的除草效果，导致全世界的农作物每年减产10%左右[5]。因此，对抗广谱性除草剂油菜品种的培育有着重要的现实意义。

目前，草甘膦(Glyphosate，N-磷酸基甲基甘氨酸)是灭生型除草剂之一[6]，具有高效、低毒、低残留、无污染以及杂草不易产生抗性的特点，且不影响后茬作物生长等优良性能[7]。闫睿智等[8]以抗草甘膦品系RH和3份恢复系6275、7-5、5200R为亲本材料进行一次杂交、三次回交、两次自交和两次背景选择，使得杂交种获得抗除草剂特性。周心童等[9]利用一年多代回交转育技术，将EPSPS基因转入5个常规亲本中，从而获得稳定的含有抗性基因的新品系材料。利用一年多代快速回交转育技术向转EPSPS基因油菜新品种进行的选育，如果配合草甘膦共同使用，有助于遏制杂草危害、降低环境污染，表现出经济性、环境友好性的优点，可为抗草甘膦油菜新品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供体亲本 以含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因的油菜品系甲HX6作为供体亲本(华中农业大学提供)。

1.1.2 轮回亲本 选用青海大学农林科学院春油菜所提供的两份优良的甘蓝型油菜恢复系(1704、3660)作为轮回亲本。其中1704为特早熟春性甘蓝型油菜品系，3660为特晚熟春性甘蓝型油菜品系，两份材料均为非转基因材料。

1.2 杂交及回交方法

2018年6月，采用甲HX6与1704、3660分别进行杂交，获得F1。2019年1月，将F1分别与各自的轮回亲本进行回交，得到BC1F1世代。2019年采用目标基因特异性引物分析BC1F1群体，选择在目标位点表现为杂合型且遗传背景与轮回亲本相似度高的单株继续与1704、3660进行回交，获得BC2F1世代。2020年采用相同的方法获得BC3F1世代。

1.3 DNA提取及除草剂抗性基因的分子标记检测

采用CTAB法[10]提取亲本以及春性甘蓝型油菜转育后代的叶片基因组DNA。参考文献[11]方法检测抗性基因I.variabilis-EPSPS*。该引物用于检测油菜转化体的特异性，将其命名为MEPSPS。上游引物序列：5′-ATACGCTCCCACATCCTGTC-3′，下游引物序列：5′-ATTAGCGCTAGGGACGTGAG-3′。

滑动网格方法是对边界修正方法的一个补充，改进算法对稠密区域进行边界修正，仅仅确定了聚类的边界，而对于没有相邻稠密单元的低密度网格单元，其中的数据点会被作为孤立点处理，使得聚类的准确性降低。该方法采用滑动网格的思想，搜索没有邻近稠密网格的稀疏网格单元，对可以组成田字格的网格单元做进一步划分，将新划分的网格沿特定方向滑动，尽可能寻回稀疏区域的稠密网格。具体方法为计算各网格的矢量坐标以及网格滑动的方向矢量其中c为0田字格中所有网格的公共顶点，gi为网格ui的重心，计算公式如下：

针对这些不可避免的自然因素对档案的影响，就要建立起以预防为主，修缮为辅的档案保护模式，应建立起专门的档案库房馆并使用相关的合理设备。该馆的温度、湿度等都要符合档案的保存条件，而且该馆在建造时，应采用节能、环保的材料，要重点注意库房的防火、防水，防空气污染、防有害生物等情况，从而建立一个良好的档案保存环境。对电子档案来说，要以预防信息泄露和保障信息安全为主，建立起覆盖各层次的网络环境。同时，要对毁坏性的档案进行修补，包括档案去污和对档案馆进行驱虫灭菌等，合理的档案预防和修补技术能有效保护档案的安全。

PCR体系：0.25 mmol/L 10×Buffer 2μL，2 mmol/L dNTPs 1.6 μL，1UTaq酶 0.2 μL，0.5 mol/L上、下游引物各1 μL，60 ng模板DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。循环程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环共34组；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，无毒核酸染料(4s Red Plus Nucleic Acid Stain)染色，在凝胶图像成像仪(Universal Hood Ⅱ)观察照相。

1.4 除草剂的抗性检测

对上述3份亲本材料进行PCR验证后，将抗性单株甲HX6与春性甘蓝型油菜恢复系(1704和3660)进行杂交，再回交转育获得BC3F1代。在传代进程中，分别对不同世代的材料进行分子标记辅助试样，选择筛选出含有抗性基因的单株(图2)，保证抗性基因在传代进程中不会丢失。

综上所述,对玻璃体视网膜疾病患者实施玻璃体切除术有利于促进伤口愈合,视力恢复,临床效果理想,值得临床应用与推广。

1.5 遗传背景检测

取亲本及各BC世代的转基因回交材料约2 cm2大小的嫩叶送至武汉基诺赛克公司进行遗传背景分析。遗传背景回复率的计算[12]公式：G(g)=[L+X(g)]/(2L)=1/2+(1/2)(X(g)/L)， 式中：G(g)代表g代遗传背景回复率；X(g)指回交g代表现为轮回亲本带型分子标记数量；L指选择条件下所采用所有分子标记数量，计算时假设各标记位点间独立。

2 结果与分析

2.1 I.variabilis-EPSPS*抗性基因的PCR鉴定

BC1_3660共培育成苗80株，对其全部展开背景回复率检测(表3)，群体背景回复率51.16%～86.36%，均值75.24%(>75%)，单株遗传背景和轮回亲本最高相似度达86.36%。以同样的方法获得BC2F1代、BC3F1代(背景回复率正在进行测试)。

在人工气候室内待油菜长出5～6片真叶时，采用小型手动喷雾器喷施1次90 mg/L 41%农达异丙胺盐制剂，保证每单株用药量在3 mL左右。在喷施处理前、后的1～4周内观察并调查其抗性。

2.2 喷药筛选抗性材料

为了快速得到背景回复率结果，将BC1_1704和BC1_3660所有材料的叶片送至武汉基诺塞克公司进行背景回复率分析。BC1_1704共成苗70株，群体背景回复率62.00%～83.82%，平均背景回复率72.27%(<75%)。由表2可知，部分单株的背景回复率达到75%的标准，但往往还是有部分不满足此标准，回交群体回复为轮回亲本基因型往往会出现一些偏离。结合前面PCR抗性基因检测结果，选择背景回复率高的5个单株进一步与轮回亲本回交获得BC2F1代。由于背景回复率试验花费时间较长，先对BC2F1代进行前景选择，选择含有抗性基因且生长势较好的单株与轮回亲本1704品系进行回交获得BC3F1代(背景回复率正在进行测试)。

2.3 背景分析

提取BC1F1群体DNA，展开背景回复率分析。基于每个位点的测序数据，分析各目标位点的基因型，统计发现，群体中需要检测的基因型共有33 790个，最终获得了有效数据(Depth≥30)的基因型比例为94.55%，平均测序深度为4 011.70倍。

表1 目标位点在部分样品中的测序深度统计表

运用90 mg/L 草甘膦溶液，单株受药量3 mL，对回交后代予以充分喷药，对植株进行抗药性观察，发现7～9 d后，不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的单株出现中心叶片颜色泛黄，并逐渐外扩，15～20 d 后整株死亡。含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因单株不受影响，生长良好。以1704为轮回亲本所获得的BC1F1代(简称BC1_1704)共培育出70株，待成株后全面喷施除草剂，20 d后清点成活率，发现共30个单株成活，占比42.86%。检测发现单株均含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；其余40个单株全部死亡，经检测这些单株均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以1704为轮回亲本获得的BC2F1代(之后称为BC2_1704)共成苗50株，其中32株正常存活，经检测这些单株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因，其余单株死亡。以3660品系为轮回亲本获得的BC1F1代(之后称为BC1_3660)共成苗80株，除草剂喷施后46株(57.5%)能够正常存活，在3660品系，含有抗性基因的单株共46株，经检测这些单株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以3660品系为轮回亲本获得的BC2F1代(之后称为BC2_3660)成苗60株，喷施除草剂后有15株生长正常；检测死去单株，发现均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因(图3)。

表2 BC1_1704背景回复率统计表

选用目标基因特异性引物对本研究中采用的3份亲本材料进行扩增，甲HX6中扩增得到了片段大小为732 bp的目标片段；而特早熟(1704)与特晚熟(3660)甘蓝型油菜中均未扩增出732 bp的目标条带(图1)。经过分析表明，I.variabilis-EPSPS*基因已成功转入甲HX6品系中。

甘肃省农业科学院蔬菜研究所副所长张玉鑫介绍说，武威地区全年降水量102-200毫米，蒸发量却在2000毫米以上，这是其土壤严重干旱缺水的重要原因。十几年来，在当地农业部门的大力支持引导下，设施农业蓬勃发展，尤其是依托当地日照资源发展的日光大棚，为农户带来了可观的收入，此时的大漠已是欣欣向荣。据统计，武威日光温室和塑料大棚面积已达到17.2万亩，其中，日光温室就占到了14.1万亩，是甘肃重要的蔬菜产区。但同我国其他省份一样，由于多年来肥料的不合理使用，武威地区土壤板结严重，瓜果蔬菜品质逐年下降，农户们看在眼里，急在心上。

表3 BC1_3660背景回复率统计表

表3(续)

3 讨论与结论

(1)目前，I.variabilis-EPSPS*基因是控制油菜草甘膦抗性的一个重要基因。抗草甘膦油菜是中国推广范围最广的一类抗性油菜品种，但由于我国尚未批准转基因油菜的种植，导致了转基因作物种质资源匮乏，近年来对抗性作物的转育已成为重要的研究目标[14-15]。而杂交转育是作物遗传育种的基本方法，可以利用不同的亲本配制杂交组合，在分离后代中定向选育，获得不同性状聚合的新品种[16]。本研究利用李杰华等[17]所提供的甲HX6含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的单株，与特早熟与特晚熟甘蓝型油菜品系1704、3660进行杂交转育，最终获得含有抗性基因的特早熟与特晚熟春性甘蓝型油菜恢复系。

4.2 各地年降水量在20世纪60年代中期和80年代末出现异常偏多，夏季降水量异常对全年降水异常的贡献最大。

(2)草甘膦是通过茎叶传导组织传递至植物全株，促进杂草死亡的一类内吸传导型除草剂。但在植物幼嫩期无效，这是由于幼嫩期叶面小、运输组织不发达。生长旺盛的植物其传导组织完善，叶面积较大，利用草甘膦能达到显著的除草效果[1]。根据柳寒等[1]对拟南芥苗期、苔期抗性研究结果显示，草甘膦直接喷至植物生殖器官，阻碍其发育。为有效发挥除草剂的作用，就要求选对喷洒时间，在作物苗期进行喷洒效果较好。本研究以此为参照，选择各轮回世代的苗期进行喷施，不会对作物产量产生影响。对不同试验材料喷施除草剂，喷施浓度参照李杰华等[17]研究的浓度参数，利用90 mg/L的41%农达异丙胺盐制剂进行喷施，在喷施后7～10 d内，植株产生轻微药害反应，此类单株中多数在分子检测时均有抗性基因存在；在喷施后15～20 d内，非抗性单株全部死亡。

(3)在原向阳等[18]、袁权等[19]研究中均发现喷施草甘膦后，植株叶片中叶绿素含量出现不同程度的降低。光合强度的大小直接取决于叶绿素含量的高低，喷施草甘膦后，导致叶片的光合作用降低，间接影响各器官内的干物质含量。本研究可以直接观测到喷施过草甘膦的叶片颜色比未喷施过草甘膦的叶片颜色浅，在今后的研究中，将对草甘膦与叶绿素含量的相关性进行验证。