MicroRNA-155在原发性免疫性血小板减少症患儿外周血单个核细胞中的表达及意义

散琴，崔莹莹，柯盈月

十堰市妇幼保健院检验科，湖北 十堰442000

原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)属于临床上较为常见的一种出血性疾病，亦是免疫性综合病症之一[1]。其主要临床特征为血液循环内存在一定量的抗血小板抗体，从而导致血小板损害明显，引发紫癜，且骨髓内的巨核细胞正常或增多，幼稚化，进一步促进血小板减少[2]。迄今为止，关于原发性ITP的具体病因以及发病机制尚未彻底明确，近年来研究发现自身免疫功能异常可能在该病的发生、发展过程中起着至关重要的作用[3]，其中自身免疫功能的异常可能引起患儿产生抗血小板抗体，进一步破坏大量血小板，继而导致血小板的减少，引起B细胞过度活化产生抗体，而后辅助性T细胞对其进行免疫应答，最终引起免疫紊乱并产生细胞毒性[4-5]。MicroRNA-155转录源自21号染色体B细胞整合簇区域，和B淋巴细胞分泌自身抗体密切相关，可在一定程度上影响B淋巴细胞功能[6]，因而MicroRNA-155与ITP的发病可能存在关联。鉴于此，本文通过研究MicroRNA-155在原发性ITP患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表达，并分析其与血小板计数(platelet count，PLT)、细胞因子及T淋巴细胞亚群的关系，旨在初步探明MicroRNA-155在ITP发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取十堰市妇幼保健院2015年2月至2019年6月收治的83例原发性ITP患儿纳入研究(病例组)。纳入标准：(1)诊断参考《血液病诊断及疗效标准》[7]中ITP相关诊断标准；(2)入院前尚未接受ITP相关治疗；(3)无临床病历资料缺失。排除标准：(1)因糖尿病、药物以及自身免疫疾病导致的继发性ITP患儿；(2)心、肝、肾等重要脏器受损的患儿；(3)正参与其他研究的患儿。病例组患儿中男性46例，女性37例；年龄4个月～10岁，平均(4.96±2.12)岁。另选取同期到我院体检的健康儿童80例作为健康组，其中男性45例，女性35例；年龄4个月～11岁，平均(4.79±2.10)岁。两组受检者的上述指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。入组儿童的监护人均对研究知情，并在同意书上签字，研究过程严格遵守《赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 观察指标与检测方法

1.2.1 PBMC中MicroRNA-155表达水平的检测 病例组患儿入院次日、健康组儿童体检当日采集外周静脉血5 mL，以Ficoll-Hypaque密度梯度法离心分离PBMC，用含2%的胎牛血清磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加入TRIzol试剂后提取PBMC中总RNA，具体操作务必以试剂盒说明书为准。使用MicroRNA特异的引物及反转录试剂盒反转录为互补DNA，利用RNA分离试剂盒提取样品中的总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA样品于260 nm以及280 nm处的吸光度，若吸光度在1.8～2.0内说明RNA纯度良好，随后逆转录成cDNA。条件为42℃反应1 h，70℃反应10 min。使用TaqMan MicroRNA检测试剂盒(Applied Biosystems)进行RT-PCR检 测miR-155相对表达量。反应条件为95℃预变性40 s、95℃变性5 s、60℃反应0.5 min，每个设置含3个平行，总共循环40次。MicroRNA-155引物序列如下：正向：5'-GCGGCGGTTAATGCTAATCGTG-3'，反 向：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3'；以U6作为内参，对照物引物序列为：正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。根据Ct值以及通过2-△△Ct方法计算miR-155相对表达量。每个样本做3个重复，取平均值。

1.2.2 PLT、细胞因子及T细胞亚群的检测 取其余三份血样，分装于A、B、C三管，A管采用国产全自动血液分析仪(型号BC-6800)进行PLT的检测；B管血样经3 000 r/min离心10 min后取上清进行细胞因子的检测：细胞因子主要包含干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，以酶联免疫吸附法完成检测，具体操作务必遵循试剂盒说明书进行(武汉博士德生物科技有限公司)。C管血样应用流式细胞仪检测T细胞亚群水平，主要指标为Th1、Th17、Th2、Treg，具体操作务必以仪器相关说明书进行。

1.3 统计学方法 应用SPSS24.0软件对研究数据进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验；计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验；采用Pearson相关性分析PBMC中MicroRNA-155表达量与PLT、细胞因子、T细胞亚群的关系。检验水准为α=0.05，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者PBMC中MicroRNA-155相对表达量及PLT水平比较 病例组患儿PBMC中MicroRNA-155相对表达量明显高于健康组，且PLT水平明显低于健康组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 两组受检者PBMC中MicroRNA-155表达量及PLT水平比较(±s)

表1 两组受检者PBMC中MicroRNA-155表达量及PLT水平比较(±s)

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2.2 两组受检者的血清细胞因子水平比较 病例组患儿的血清IFN-γ、IL-2水平明显高于健康组，而IL-4、IL-10水平明显低于健康组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 两组受检者的血清细胞因子水平比较(±s，pg/mL)

表2 两组受检者的血清细胞因子水平比较(±s，pg/mL)

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2.3 两组受检者的T细胞亚群比较 病例组患儿的Th2、Treg水平明显低于健康组，Th1水平明显高于健康组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，但两组的Th17水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 两组受检者的T细胞亚群比较(±s，%)

表3 两组受检者的T细胞亚群比较(±s，%)

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2.4 PBMC中MicroRNA-155相对表达量与PLT、细胞因子、T细胞亚群的相关性Pearson相关性分析结果显示：PBMC中MicroRNA-155相对表达量与PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈负相关(P＜0.05)，而与IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相关(P＜0.05)，与Th17无明显相关性(P＞0.05)，见表4。

表4 PBMC中MicroRNA-155相对表达量与PLT、细胞因子、T细胞亚群的相关性

3 讨论

ITP作为临床多见的自身免疫性出血性疾病之一，其发病原因以及机制仍处于探索阶段，因此临床上尚无治疗ITP的特异性手段[8-9]。目前有研究认为ITP可能和T细胞亚群紊乱有关，如Th1、Th2细胞的平衡紊乱与ITP的发病有关，Treg细胞的免疫调节失衡导致ITP病情加重[10]，Th17细胞作为新发现的T细胞亚群，其与自身免疫病存在较为明显的联系[11]。近年来的研究发现ITP患者体内多种细胞以及体液中存在多种MicroRNA表达异常现象[12-13]，提示MicroRNA表达异常可能参与了ITP的发生、发展过程。MicroRNA-155属于MicroRNA家族成员之一，随着其表达逐渐升高，机体B细胞会被过度激活，进一步合成、分泌大量特异性抗体，从而导致机体免疫系统亢进的发生，继而促进了免疫性疾病的发生[14-15]。另有相关研究报道证实，MicroRNA-155在系统性红斑狼疮以及重症肌无力等一系列自身免疫性疾病中均存在异常表达[16-17]。由此，本文通过检测MicroRNA-155在ITP患儿PBMC中的表达水平，旨在初步探讨其在ITP发病机制中的作用。

本文结果发现，病例组PBMC中MicroRNA-155相对表达量显著高于健康组，PLT低于健康组，提示了MicroRNA-155在ITP患儿PBMC中存在明显高表达，且可能参与了ITP的发生、发展过程。分析原因为B淋巴细胞内的MicroRNA-155可能是通过对自身反应性B细胞产生过度激活作用，继而促进IgG以及IgM等特异性抗体的合成与分泌，参与血小板的破坏，最终引发ITP的发生，这与郭莹等[18]的研究报道相吻合。此外，ITP的发生可能和原发感染导致的长期免疫应答异常有关，从而促进了免疫球蛋白和血小板表面抗原的结合，进一步诱导自然杀伤细胞NK进行外毒素分泌型的细胞毒性作用损伤血小板，最终导致PLT的明显下降。IFN-γ、IL-2主要是由Th1细胞分泌，主要作用是直接杀伤抗原递呈细胞或活化杀伤性细胞，继而参与细胞免疫的调节；而IL-4、IL-10主要是由Th2细胞分泌而来，可直接抑制杀伤性细胞或促进B淋巴细胞分化增殖产生抗体，进一步参与体液免疫。本研究结果显示病例组血清IFN-γ、IL-2水平显著高于健康组，而IL-4、IL-10水平均显著低于健康组，这提示了Th1、Th2细胞失衡可能参与了ITP的发生、发展过程。究其原因，IFN-γ、IL-2分泌增加会导致免疫环境紊乱，影响CD4+T细胞增殖分化为Th2类细胞，从而减少了Th2类细胞因子的产生；而IL-4、IL-10可抑制CD4+T细胞增殖分化为Th1类细胞，导致Th1分泌的细胞因子减少，正常生理状态下二者处于动态平衡[19-21]，而随着IFN-γ、IL-2水平的升高以及IL-4、IL-10水平的降低，势必导致Th1增加，Th2减少，引起Th1、Th2细胞失衡，进一步促进大量血小板抗体的生成，同时激活了单核-巨噬细胞的吞噬功能，导致大量被致敏的血小板被吞噬消灭，最终引发了ITP[22]。这在王莹等[23]的研究报道中得以佐证：ITP患儿存在明显的T淋巴细胞亚群失衡，且存在不同程度的细胞因子紊乱。然而，上述研究分析了不同年龄阶段ITP患儿的细胞因子表达水平差异，而本研究并为进行该方面的研究，这为我们今后的研究提供了新的方向。另外，Pearson相关性分析显示PBMC中MicroRNA-155表达量与PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈负相关关系，而与IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相关关系，初步说明MicroRNA-155可能是通过影响IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-2的合成与分泌，进而对患儿的免疫系统造成影响，进一步介导ITP的发生、发展，但其具体的影响机制尚待日后进一步探讨明确。然而，本研究尚且存在样本量较少的缺陷，可能导致研究结果发生偏颇，值得临床重点关注。

综上所述，ITP患儿的PBMC中MicroRNA-155存在明显高表达，且与PLT、IL-4、IL-10、Treg及IFN-γ、IL-2、Th1、Th2水平均具有一定的相关性，可能通过影响免疫系统参与了ITP的发病过程，具有作为ITP患儿治疗靶点的潜力。