铜仁市育龄妇女耳聋基因突变检测结果分析

龙丽 田松娅 雷星 罗霞

重度听力损失是最常见的先天性疾病之一，在出生时约有1/1 000 的新生儿出现［1］。2006年第二次全国残疾人抽样调查结果显示：我国听力残疾者高达2 780 万，占残疾人总数的33%，其中7 岁以下的听力残疾儿童高达80 万人，并以每年3.5 万聋儿的速度增长，很大部分为先天性耳聋［2］。这些患儿的出生给家庭及社会造成很大的不幸和沉重的负担。统计数据显示：约60%的耳聋属于遗传性耳聋。正常群体中携带耳聋基因的比例高达5%～6%［3］，因此耳聋发病率一直居高不下。如何预知这些先天性耳聋患儿的出生，是在产前检查过程中需要解决的问题。遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4及线粒体基因（mtDNA12SrRNA）和GJB3 的突变是导致大部分遗传性耳聋发生的主要突变基因。本次研究主要探讨铜仁市各族育龄妇女中4 个常见遗传性耳聋基因的分布情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年8月至2020年10月在本院进行产前检查的各族育龄妇女1 723 例为研究对象，年龄17～47 岁，平均年龄（28.30±2.15）岁。其中汉族628 例，400 例苗族，469 例土家族及226 例侗族孕妇。所有研究对象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血液标本采集

按照采血标准操作流程采取受检者外周血3～5 mL，加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝的采血管，4℃冰箱保存血样。

1.2.2 血液基因组DNA 提取

DNA 提取试剂盒使用广东凯普科技生物有限公司提供的离心柱提取试剂盒。具体步骤按照说明书进行。

1.2.3 PCR 扩增

扩增试剂由广东凯普科技生物有限公司提供的扩增试剂盒，扩增程序为95℃15 min，97℃50 s、60℃60 s、72℃120 s 共35 个循环，72℃10 min。

1.2.4 扩增产物杂交

PCR 产物95℃变性10 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。按要求放好配件，铺好杂交膜条，预杂交45℃2 min 以上；开泵，排杂交液；杂交清洗3～4 次；加入封阻液，封阻；加酶标液0.5 mL；溶液A 清洗四次；加显色液0.5 mL，显色6 min；加杂交液0.8 mL，清洗3 次；加蒸馏水清洗晾干。

1.2.5 结果判读

①空白对照：不出现蓝紫色斑点。②正常样本：在生物素点及所有正常探针处出现蓝紫色斑点。③阳性样本：正常探针及对应的突变探针位点都出现蓝紫色斑点，为该位点的杂合突变或杂合缺失；突变探针位点出现蓝紫色斑点，而对应的正常探针位点没有出现蓝紫色斑点，为该位点的纯合突变或纯合缺失。④其它：若某个检测位点的正常探针和突变探针都未出现蓝紫色斑点，可能是该检测位点出现新的突变类型，建议做进一步的分析，如测序等。

1.3 统计学方法

使用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计数资料用n（%）的形式表示，用卡方检验或Fisher检验方法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1 723 例育龄妇女中检测出常见耳聋基因突变位点结果分析

本次研究共检出耳聋基因携带者3.6%（62/1723）。见表1、图1、图2。

表1 1 723 例孕妇耳聋基因突变位点分布情况Table 1 Distribution of deafness gene mutation sites in 1 723 pregnant women

2.2 不同民族之间的携带率比较分析

不同民族之间的携带率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图3。

图1 常见耳聋基因突变位点Figure 1 Common deafness gene mutation sites

图2 耳聋少见基因突变位点测序结果Figure 2 Sequencing results of rare deafness gene mutation sites

表2 不同民族之间的携带率比较结果［n（%）］Table 2 Comparison results of carrying rate among different nationalities［n（%）］

图3 不同民族之间的携带率比较柱状图Figure 3 Bar chart of comparison of carrying rate among different nationalities

2.3 不同民族之间的突变类型比较分析

不同民族之间的主要耳聋基因突变类型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同民族之间的常见突变类型比较［n（%）］Table 3 Comparison of common mutation types among different nationalities［n（%）］

3 讨论

耳聋依据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合征性耳聋（SHL）和非综合征性耳聋（NSHL）［4］。本次研究中耳聋基因的突变频率为3.6%，略低于张昊晴等的报道［5］。GJB2 基因编码的Cx26 属于缝隙连接蛋白基因家族，与相邻细胞的缝连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用［6］。GJB2 基因突变方式复杂多变，目前已有140 多种突变方式被报道［7］，其中显性突变9 种，235delC是最常见的致病性突变［8］，纯合突变导致常染色体隐性遗传性耳聋，患者多为双耳重度耳聋，不仅纯合突变可以致聋，235delC 和其他致病突变位于两条不同的染色体上形成双重杂合性突变时，也可以导致耳聋。本研究结果符合此前235delC为国内最常见基因突变的结论［9］。

SLC26A4基因位于人类染色体7q31，含21 个外显子，编码含有780 个氨基酸的蛋白质Pendrin［10］。Pendrin 作为离子转运体，调节内淋巴液的离子平衡。SLC26A4基因IVS7-2A＞G 突变是中国大前庭导水管患者群的热点突变位点，15.23%的耳聋患者携带此突变，74.8%的大前庭导水管患者携带此突变［11］。本次研究中SLC26A4 的携带率为0.99%，其中IVS7-2A＞G 携带率为0.81%，是SLC26A4 基因突变位点中最常见的类型。SLC26A4 基因突变耳聋患儿出生时听力筛查一般表现为正常，易被忽视，携带者筛查是避免SLC26A4 基因突变所致后天性遗传性耳聋出生缺陷发生的重要手段。

线粒体12SrRNA A1555G 突变、C1494T 突变等与氨基糖甙类药物导致的耳聋的发病密切相关［12］。有此突变患者的线粒体12S 核糖体的空间结构与氨基糖苷类药物作用的靶点更加相似，一旦接触氨基糖苷类药物就很容易与之结合，导致线粒体组织的破坏，最终引起药物性听力障碍的发生［13］。本次研究中检测出突变位点为m.1494C＞T和m.1555A＞G，主要突变位点为m.1555A＞G，共检出6 例mtDNA 耳聋基因携带者，mtDNA 耳聋基因携带率为0.35%，低于此前储穆庭所作研究［14］。本研究结果提示在育龄妇女中进行线粒体12SrRNA基因筛查，及时发现线粒体突变携带者，并对携带者及其所有母系家属进行宣教禁止使用氨基糖苷类药物，可以有效避免药物性耳聋的发生。

GJB3 基因是1998年我国科学家夏家辉院士研究报道的第一个“本土基因”［15］，该基因538C＞T 位点的突变被认为与显性遗传高频听力下降有关。GJB3 基因与GJB2 基因虽然不在同一条染色体上，但都编码连接蛋白，在内耳离子平衡中发挥作用，按照双等位基因致聋的模式，有可能GJB2 基因与GJB3 基因共同导致耳聋患者的发病。如果GJB3基因c.538C＞T 杂合突变携带者与GJB2 基因杂合突变者婚配就可能导致下一代耳聋遗传病的发生。因此GJB3 的突变频率在育龄妇女筛查中虽然不高，但其筛查也不能忽略。

此次在汉族，侗族，土家族，苗族育龄妇女中所做的研究与此前李琦，郭斌等［16-17］所做研究结果有差别，这可能是由于本次研究所检测样本数量太少，抽样误差所致；也可能是不同地域和民族之间本身存在有差异。

我国是一个多民族大家庭，幅员广阔，各地区人群的遗传特点有很大的差异。因此，在不同地区和不同民族中，应结合当地耳聋基因的表现特征，制定出适合本地区的筛查策略及预防措施。同时由于基因检测技术的快速发展也积极推动了遗传性耳聋诊断的发展。在分子诊断技术的基础上结合地方实际情况建立适宜的遗传性耳聋基因筛查模式，才能实现降低遗传性耳聋出生缺陷的目标。