几种烟叶致香成分对烟草甲的引诱活性分析

钟尚上，苟春苗，马建勋，孙倩，黄兰，程新胜*

1.中国科学技术大学烟草与健康研究中心，合肥市徽州大道1129号230051

2.四川省烟叶复烤有限责任公司，成都市高新区世纪城路936号610041

3.华环国际烟草有限公司，安徽省凤阳县门台工业园区233121

4.安徽中烟工业有限责任公司，合肥市高新区天达路9号230088

烟草甲［Lasioderma serricorne（Fabricius）］属鞘翅目窃蠹科，是重要的仓储害虫之一［1-2］。可为害豆类、茶叶、谷物、中草药、书籍、皮革及家具等［3-5］，有报道在不同类型超市、牙科诊所已监测到烟草甲［6-7］，甚至在幼儿肠道排泄物中也发现烟草甲［8］。烟草甲宿主广泛，可为害多种仓储物，严重为害烟草及其制品［9］。目前有关烟草甲化学生态学方面的研究多集中在驱避剂选择上［10-14］。吕建华等［15］采用Y型嗅觉仪就臭椿树皮、蛇床子、高良姜根茎、木香薷、苍耳子、桂皮、艾叶、烟叶和全麦粉等植物材料对烟草甲成虫选择行为进行了试验，发现烟叶、全麦粉、苍耳子、蛇床子对烟草甲成虫有较强的引诱作用。赵艳珍等［16］研究提出，辣椒、花椒、陈皮、香叶、白豆蔻、甘草、当归、白芷、罗汉果和绿茶等10种具有不同气味特征的植物样品对烟草甲成虫诱集能力不同，辣椒、罗汉果、白芷、绿茶粉末对烟草甲成虫的引诱活性较高，引诱指数均在45%以上。孟国玲等［17］试验表明，烟草甲倾向于选择可溶性总糖和石油醚提取物含量较高且纤维素含量较低的烟叶，在这种类型的烟叶上产卵、取食，导致可溶性总糖和石油醚提取物含量较高的中高档烟叶在仓库中更容易受到烟草甲的为害。前人研究表明，烟叶对烟草甲有较强的诱集作用且与烟叶中化学成分有关，但与何种化学成分相关并不明确。为此，选取二氢猕猴桃内酯、β-大马酮、异戊二烯、麦芽酚、2,3,5,6-四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、异戊酸、3-甲基戊酸、新植二烯、烟碱等10种具有代表性［18-20］的烟叶致香物质进行了烟草甲选择行为比较试验，旨在明确烟叶诱集烟草甲的具体化学物质，为烟草甲的综合控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 试验材料

供试烟草甲为中国科学技术大学烟草与健康研究中心实验室饲养的试验种群，饲养于人工气候箱内。饲养条件：光周期为16 L∶8 D（暗期在24：00至次日08：00）；光期温度为（30±2）℃，暗期温度为（28±2）℃；相对湿度为50%～70%；烟草甲虫以含有5%酵母粉的小麦粗全粉为饲料［21］。试验前将烟草甲的蛹从食料中挑出后，选取羽化5～8 d的成虫，试验前烟草甲成虫放入空瓶中饥饿处理12 h，备用，供试后的烟草甲均使用1次。

白肋烟、雪茄烟叶、香料烟、晒红烟、烤烟（安徽）、烤烟（福建）、烤烟（四川）、烤烟（云南），均由安徽中烟有限责任公司提供。烟叶相关信息见表1。雪茄烟叶为茄衣叶，其余类型烟叶均为打叶后的片烟，等级为复烤后企业标注的等级。

表1 供试烟叶信息Tab.1 Information on tested tobacco leaves

1.1.2 试剂与仪器

二氢猕猴桃内酯、β-大马酮、异戊二烯、麦芽酚、2,3,5,6-四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、异戊酸、3-甲基戊酸、新植二烯、异丙醇均为分析纯，购自国药商城；烟碱由安徽中烟工业有限责任公司技术中心提供。

方形烟草甲选择仪、改进型Y型嗅觉仪（均由本实验室设计，中国科学技术大学玻璃厂吹制）；FA1004电子分析天平（感量0.000 1 g，上海精密科学仪器有限公司）；可调式移液枪（量程10～100μL，国药化学试剂有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州市长城科工贸有限公司）；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；微型玻璃转子流量计（上海仪川仪表厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 烟叶化学物质的选择

根据致香物和香气前体物的关系［22］，烟叶致香成分主要源于：①质体色素、西柏三烯类等大分子化合物降解；②类酯的代谢产物；③美拉德反应产物；④生物碱及其转化物。以物质类型、烟叶中含量为考量，选取10种（表2）具有代表性的致香物质，均使用异丙醇稀释至体积分数0.5%。

表2 致香物质及来源Tab.2 Aroma components and their sources

1.2.2 烟叶致香成分对烟草甲的引诱效果

根据烟草甲有进入狭窄空间的倾向等行为学特点［23］，同时为便于烟草甲试虫的投放与观察，试验中自行设计了Y型嗅觉仪（图1D），整个测试装置构成见图1。在温度（28±2）℃，相对湿度50%～70%的洁净房间中进行试验。为防止光线的干扰，窗帘紧闭，且在Y型嗅觉仪上方放置1盏白色荧光灯（40 W）以保证光照强度一致。装置连接完成后，将15 mm×20 mm滤纸条放入气味源瓶（图1C）中，将20μL稀释后的致香物质试剂及对照异丙醇分别滴加到不同气味源瓶的滤纸片上。将滤纸对折后从Y型嗅觉仪（图1D）瓶口处探入，使用毛笔将已经饥饿处理的烟草甲成虫顺着滤纸折痕轻轻扫入Y型嗅觉仪中。打开真空泵（图1E），调节气体流速为500 mL/min，空气经活性炭及带蒸馏水的脱脂棉过滤并加湿（图1B），两股气流分别流经气味源瓶后进入Y型嗅觉仪。

图1 Y型嗅觉仪测试装置Fig.1 Y-tube olfactometer testing device

试验过程中，若试虫爬至管臂的泡涨处（图1D）且活动时间持续超过30 s，则记为该虫选择该臂所连接的气味源；若试虫释放后，在30 min观察时间内没有进入与气味源连接管臂或在泡涨处持续活动时间未超过30 s，则视该试虫为对气味源无选择。每次试虫15头、3次重复。每次测定后更换Y型嗅觉仪及气味源瓶，Y型嗅觉仪及气味源瓶清洗后，210℃条件下烘干备用。

参照Zhang等［11］行为反应指数的计算方法，判断不同味源间的差异。平均引诱活性指数RI的计算公式：

式中：Nt为处理支臂的烟草甲头数；Nc为对照组支臂烟草甲头数。

1.2.3 烟草甲对味源物质的反应

选取对烟草甲最具引诱活性的味源物质，分别配制成1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5和1.0×10-6mol/L浓度的试剂，以测试不同浓度味源物质对烟草甲的影响。参照文献［24］中的方法，将直径为120 mm的培养皿由中间均分为两部分，对称放入直径为15 mm的滤纸圆片，两侧圆片上分别加入20μL的待测味源物质及对照异丙醇，放入10头烟草甲于培养皿中间线上，封闭30 min后观察烟草甲的分布状况。每组重复3次。以选择百分率表示烟草甲的选择性，计算公式［25］：

式中：CI为选择百分率，%；Lt为选择味源的烟草甲头数；La为投入的烟草甲总头数。

1.2.4 烟草甲对不同类型烟叶的选择性

当不同仓储物品进入1个仓库时，烟草甲会发生迁移，在不同的仓储商品上重新分布［26］，这可能是因为不同商品对烟草甲诱集能力不同所致。为测定烟草甲对不同仓储物的自主选择行为，设计了方形模拟环境装置。装置设计主要依据烟草甲的个体大小，为减少气流扰动对试验带来的误差，其上有一磨砂玻璃盖片，见图2。同时，考虑烟草甲昼伏夜出的特点，测试时间选在夜间进行。选择试验分为5组，见表3。

图2 方形烟草甲选择仪平面图Fig.2 Square plan of selection behavior testing instrument for L.serricorne

表3 烟叶类型选择试验分组Tab.3 Grouping of tobacco leaves for tobacco type selection test

烟叶样品均取叶片中部，剪成1 cm长条状，每份供试烟叶均为10 g。用指形管选取羽化后成虫12只，12 h饥饿处理后放入方形嗅觉仪投放区。8 h后（1个晚上）统计烟草甲分布状况，烟草甲进入A、B、C和D区域内视为烟草甲选择了该区域的烟叶，未进入A、B、C和D区域视为未作出选择。每组试验重复5次，每次试验前将方形选择仪打开，用毛刷清除烟叶残余粉尘并使用抹布彻底清洁方形嗅觉仪各区域，并用电吹风机吹扫后在通风环境下放置4 h使气味散尽。

1.3 数据处理

使用SPSS 25进行数据统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。利用Origin 2016软件制图。

2 结果与分析

2.1 烟叶致香成分对烟草甲的引诱活性

烟草甲对于不同烟叶致香成分的行为响应见表4，不同致香物质对烟草甲平均引诱指数见图3。可以看出，二氢猕猴桃内酯、β-大马酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪、烟碱均对烟草甲表现出较强的引诱活性，其中以2,3,5,6-四甲基吡嗪引诱烟草甲数量最多，与对照间差异达到显著水平。从图3可见，2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲的引诱指数达86.67%；烟碱次之，二氢猕猴桃内酯、β-大马酮再次之，引诱指数分别为69.23%、50%和50%。10种烟叶致香物质中，麦芽酚的引诱活性最小，引诱指数为0。

表4 烟草甲成虫对不同烟叶致香成分的行为响应①Tab.4 Behavioral response of L.serricorne adults to different aroma components in tobacco leaves

图3 不同烟叶致香成分对烟草甲的平均引诱指数Fig.3 Average attractive indexes of different aroma components to L.serricorne

2.2 烟草甲对不同浓度气味源物质的反应

通过气味源物质Y型嗅觉仪测定可知，2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲的诱集能力最强，故用培养皿法进行了不同浓度2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲的影响试验，结果见表5。由表5可见，浓度为1.0×10-3mol/L时，烟草甲对2,3,5,6-四甲基吡嗪的选择百分率最高，达80%。在最高浓度为1.0×10-2mol/L时，选择百分率仅为66.67%。

表5 烟草甲对不同浓度味源的选择性Tab.5 Select percentage of L.serricorne to odor sources with different concentrations

2.3 烟草甲对不同类型烟叶的选择性

烟草甲对不同类型及不同产地烟叶的选择性见图4。图4 A中香料烟与烤烟对烟草甲的吸引力明显大于白肋烟与雪茄烟叶；而图4B中显示，烤烟与晒红烟对烟草甲的吸引力较高；图4C表明，烤烟与香料烟吸引力较高；图4D表明，烤烟与晒红烟的吸引力大于白肋烟与雪茄烟叶。总体来看，与白肋烟和雪茄烟叶相比，烟草甲更喜欢选择烤烟、香料烟和晒红烟，且对于烤烟的选择性最强。图4E表明，烟草甲对不同产地等级的烤烟选择性差异不大，相对而言仅对福建产区烤烟的选择性略低。

图4 烟草甲对不同类型烟叶的选择性比较Fig.4 Comparison of selectivity of L.serricorne to different types of tobacco leaves

3 讨论

本试验中发现，2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲的引诱活性最强，说明吡嗪类物质对烟草甲成虫的选择性影响较大。吡嗪类物质主要来源于Mailard反应，是该类反应中最具香味价值的成分之一［27］。Wahlberg等［19］提出烤烟在烘烤与陈化过程中发生一系列化学变化，在此期间吡嗪类、吡咯类及吡啶类成分含量显著增加，而石倩倩等［28］研究认为2,3,5,6-四甲基吡嗪在烤烟中含量明显高于白肋烟等类型的烟叶，本试验中也证明不同类型烟叶中烤烟对烟草甲的吸引力最强。说明烟草中的2,3,5,6-四甲基吡嗪等香味成分在烟草甲侵入烤烟烟叶过程中起着重要作用，2,3,5,6-四甲基吡嗪等烟草香味成分在不同类型烟叶中含量差异可能会影响到烟草甲的趋性［29-30］。

通过对不同浓度2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲引诱活性测定表明，烟草甲对不同浓度的2,3,5,6-四甲基吡嗪均表现出一定的选择性，但浓度为1.0×10-3mol/L时，烟草甲对味源物选择性最高，达到80.0%。浓度降低时，选择性也降低。2,3,5,6-四甲基吡嗪为1.0×10-2mol/L时，烟草甲的选择百分率仅为66.67%，表明香味物质对烟草甲趋性影响有适宜的浓度范围，这种情况也存在于烟草甲的驱避习性中。与Zhou等［31］报道的适宜浓度1,8-桉叶素对烟草甲的驱避作用研究结果一致。而有关烟叶致香物质对烟草甲引诱活性的实际仓储应用还有待进一步深入试验。

4 结论

烟叶中的10种致香成分中，2,3,5,6-四甲基吡嗪对烟草甲的引诱活性最高，引诱活性指数86.67%，且在浓度为1.0×10-3mol/L时，其引诱活性最强；烟碱、二氢猕猴桃内酯、β-大马酮也表现出较强的引诱活性，引诱活性指数分别为69.23%、50%和50%。在供试的5种类型烟叶中，烟草甲对于烤烟、香料烟、晒红烟的趋性明显高于雪茄烟叶和白肋烟，其中对烤烟的选择性最强。