黄芪多糖对肥胖模型大鼠胰岛素抵抗的作用研究*

魏祎

新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000

近年来，2型糖尿病的发病率逐年升高，发病人群也逐渐趋向年轻化。2型糖尿病发病的主要机制之一就是胰岛素抵抗。缓解胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病及其并发症极为重要方法之一。流行病学已证实，胰岛素抵抗是糖尿病的独立危险因素之一[1]。采用基因敲除等技术，敲除磷脂酰肌醇3激酶(P13K)调节亚基p85和催化亚基p110的基因均可导致糖脂代谢紊乱，说明P13K对调节糖脂代谢具有重要作用。生长激素、短期超量摄食、肥胖及2型糖尿病均可增加P13Kp85的表达，从而使胰岛素敏感性降低。黄芪多糖是黄芪中最重要的有效成分，研究发现，胰岛素抵抗可明显降低大鼠体内氧化应激水平，缓解糖尿病的发展[2]。本实验拟通过研究高脂饲料诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PI3K及其p85调节亚基水平的变化，以期阐明代谢综合征患者胰岛素抵抗发生的分子机制，旨在观察黄芪多糖改善胰岛素抵抗的作用及其对肥胖大鼠骨骼肌PI3K表达的影响，探讨其治疗胰岛素抵抗的作用。

1 材料

1.1 动物雄性SPF级SD大鼠48只，8周龄，体质量220～240 g，购于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0001，饲养于新乡医学院实验动物室，室温保持在22～24 ℃，相对湿度为50%～55%，明暗周期12 h，自由饮水和摄食。

1.2 药品与试剂黄芪多糖(含量：90%，方晟生物开发有限公司)；吡格列酮片(北京太洋药业有限公司，批号：180702)；大鼠胰岛素(insulin，INS)试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司，货号：F4431-A)；PrimeScript®RT-PCR 试剂盒(日本Takara公司，货号 RR014A)；PVDF膜(法国Merk公司，货号：ISEQ00010)；十二烷基磺酸钠(加拿大Wisent公司，货号：800-100-EG)；DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9018)；PI3Kp85α抗体(北京博奥森公司，货号：bsm-33219M)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(北京博奥森公司，货号：bs-0295G-HRP)；引物由英骏生物技术有限公司合成。

1.3 仪器7020型全自动生化分析仪(日立公司)；752型紫外可见分光光度仪(上海菁华科技仪器有限公司)；AllegraTMX-22R型低温高速离心机(美国Bechman公司)；DYCZ-22A型垂直电泳(北京市六一仪器厂)；Gene Genius型凝胶成象系统(美国SYNOPTICS公司)；PE-460型基因扩增仪(美国Perkin Elmer TM Corporation)。

2 方法

2.1 模型制备与动物分组将大鼠按随机数字表法分为对照组和模型组，模型组大鼠给予高脂饲料(高脂饲料组成分为：普通饲料78%+10%熟牛油+10%蛋黄粉+1%胆固醇+1%胆酸钠)，空白组给予普通饲料。饲养动物6周，将高脂模型组再次分为模型组、黄芪多糖组(400 mg·kg-1)、吡格列酮组(20 mg·kg-1)，每组12只，每日1次，连续干预4周。

2.2 生化指标的检测心脏采血，离心，使用全自动生化分析仪检测血清空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、三酰甘油(triglyceride，TG)、胆固醇(total cholesterol，TC)；酶联免疫吸附法测定胰岛素(insulin，INS)水平；同时计算胰岛素敏感指数(ISI)。

ISI= Ln[1/(FBG×INS)]

2.3 内脏脂肪相对含量(VM/W)取附睾脂肪垫、双肾周脂肪垫、大网膜膜脂肪量，并称其质量，及大鼠的体质量，计算大鼠内脏脂肪相对含量。

VM/W=(附睾脂肪垫+双肾周脂肪垫+大网膜膜脂肪量)/大鼠体质量

2.4 RT-PCR法检测大鼠骨骼肌PI3KmRNA表达取大鼠骨骼肌，提取总RNA，测定吸光度(A)值及A260/A280值并标化。每20 μL体系各取 1 μL 总RNA为模板逆转录合成cDNA。逆转录条件为：37 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min灭活反转录酶，-20 ℃ 冰箱中保存。取2 μL 逆转录产物做 RT-PCR，β-actin做内参，共50 μL反应体系。扩增条件：95 ℃预变性2 min后，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

2.5 免疫印迹法检测大鼠骨骼肌PI3Kp855α蛋白的表达大鼠骨骼肌加入蛋白裂解液匀浆后，取上清，测定蛋白浓度。取蛋白样品行凝胶电泳分离，转膜、封闭，加入一抗抗体、内参照 β-actin 和显色底物，4 ℃ 孵育过夜，加二抗。β-actin、PI3Kp85α和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗稀释倍数11 000、1500和15 000。显色、显影，扫描。应用分析软件对条带进行灰度值分析。

3 结果

3.1 黄芪多糖对肥胖模型大鼠血浆生物指标和VM/W的影响高脂饲养6周可致大鼠明显肥胖，高脂模型组体重显著增加(P<0.05，且高脂模型组较阴性对照组体重>20%)，并持续到造模第10周末；与空白组比较，模型组大鼠血清TG、TC、FINS、VF/W水平明显升高(P<0.05)，ISI明显下降(P<0.05)，提示高脂组大鼠骨骼肌存在胰岛素抵抗和血脂异常。与模型组比较，黄芪多糖组及吡格列酮组的TG、TC、FINS、VF/W水平明显降低(P<0.05)，ISI水平升高(P<0.05)。各组大鼠FBG的水平无明显差别(P>0.05)。见表2。

表2 黄芪多糖对肥胖模型大鼠血浆生物指标和VM/W的影响

3.2 黄芪多糖对肥胖模型大鼠骨骼肌PI3KmRNA和PI3Kp85α表达的影响与空白组比较，模型组大鼠骨骼肌的PI3KmRNA明显降低(P<0.05)，PI3Kp85α的蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖组和吡格列酮组鼠骨骼肌的PI3KmRNA明显升高(P<0.05)，PI3Kp85α的蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表3，图1。

表3 黄芪多糖对肥胖模型大鼠骨骼肌PI3KmRNA和PI3Kp85α表达的影响

注：A：空白组；B：模型组；C吡格列酮组；D黄芪多糖组图1 黄芪多糖对肥胖模型大鼠骨骼肌PI3Kp85α表达的影响

4 讨论

黄芪多糖是豆科植物中药黄芪的提取物，具有调节机节免疫功能、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激及抗氧化等作用[3-4]。黄芪多糖可降低糖尿病大鼠血清白细胞介素-1及白细胞介素-6，可改善糖尿病心肌脂肪酸代谢紊乱及脂毒性[5]；可通过SIRT1-PGC-1α/PPARα-FGF21信号通路改善糖脂代谢，改善胰岛素抵抗[6]。更为重要的是黄芪多糖具有双向调控血糖的作用[7]，对正常小鼠的血糖无明显影响，但却使葡萄糖负荷后小鼠血糖明显下降。PI3K途径是胰岛素信号转导通路中的主要途径之一[8]，脂质代谢紊乱对PI3K的活性产生重要影响。肥胖、高脂饮食或脂质灌注等均可明显抑制骨骼肌组织PI3K的活化。胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2在肥胖的Zucker大鼠肌肉和肝赃中显著降低，与PI3K的结合减少，引起PI3K活性减低[9]。骨骼肌和脂肪细胞中PI3K的基因表达的调控在2型糖尿病患者中存在缺陷[10]。在肥胖症及2型糖尿病患者的骨骼肌及脂肪细胞中PI3K活性随胰岛素受体底物蛋白的酪氨酸磷酸化程度降低而下降。游离脂肪酸、肿瘤坏死因子-α等致胰岛素受体底物减少，从而影响PI3K活性，说明PI3K是胰岛素受体底物的中介分子之一[11]。即PI3K活性降低，胰岛素信号无法通过PI3K通路，导致胰岛素抵抗，引起血糖升高，最终导致2型糖尿病的发生。

PI3K可分3类，结构与功能上各不相同，其中研究最广泛的为I类PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110组成。PI3K的p85调节亚单位是胰岛素受体底物-1/PI3K通路的重要组成部分，PI3K的p85亚单位在调节胰岛素信号转导通路中起着独立负反馈的作用[12-13]。经地塞米松处理过的骨骼肌细胞，过量的p85以及p85与p110之间的失衡可以改变PI3K的活性[14]。研究发现，p85-p110二聚体与p85单体比值越高，机体对胰岛素就越敏感[15-16]。机体缺少PI3Kp85α或者是PI3Kp85β都可使胰岛素敏感性增加[17-18]。细胞培养发现，PI3Kp85α表达增加造成PI3K亚基间数量的平衡被破坏，PI3Kp85α过度表达可明显抑制P13K活性[19]。使用反义核苷酸干扰p85α的表达，能够提高肥胖小鼠及(ob/ob)鼠的胰岛素敏感性[20]。因此，PI3Kp85α表达的变化将改变骨骼肌等组织对葡萄糖的利用，进而影响胰岛素的敏感性。

本研究通过用黄芪多糖干预胰岛素抵抗模型大鼠发现，黄芪多糖能调节肥胖大鼠脂代谢紊乱，改善肥胖大鼠胰岛素抵抗，可能是通过降低血清中胆固醇、三酰甘油及上调骨骼肌中PI3K来实现的。黄芪多糖改善胰岛素抵抗效果明显，有望应用于临床成为新的胰岛素增敏剂。