基于网络药理学研究赤芍治疗动脉粥样硬化的作用机制*

任玲，曹焕泽，纪文岩

1.山东中医药大学，山东 济南 250355； 2.青岛市中医医院，山东 青岛 266033

动脉粥样硬化是一种以内膜斑块为特征，可累及大中动脉的血管内膜疾病，是引起冠状动脉粥样硬化性心脏病、颈动脉疾病和外周动脉疾病最常见的潜在原因之一。高胆固醇血症、低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白降低、脂质氧化、高血压及炎症是动脉粥样硬化的最易感因素[1]。赤芍，又名山芍药、草芍药，是毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根[2]，性微寒，味苦，归肝经，功能清热凉血、散瘀止痛。《神农本草经》认为芍药可除血痹、止痛。陶弘景将芍药分为赤、白两种，认为“芍药赤者小利”。白芍的作用偏于养，能敛阴养营；赤芍的作用偏于活，可散邪活血。研究表明赤芍的化学成分包含萜类及其苷、黄酮类及其苷、鞣质类、挥发油类、酚酸及其苷等，有保肝、抗炎、抗肿瘤、抗血栓、抗氧化、抗内毒素等多种药理作用，且对心血管系统及神经系统有保护作用[3]。

Hopkins[4]认为将化学基因组学与网络生物学相结合，可形成网络药理学来发现药物或开发辅助药物设计，能更科学、系统地阐释药物的作用机制。中医的整体观与新兴的网络药理学和网络生物学的关键思想有很多共同之处。中药网络药理学是从系统生物学和分子水平的角度发现中药有效成分，通过将研究范式从目前的“一靶一药”模式更新为“网络靶向多组分”模式，为中医药从经验医学向循证医学的转化提供了一种新的研究范式。

1 方法

1.1 筛选赤芍的有效化学成分及靶点通过中药系统药理学分析平台(TCMSP：http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.pHp)对赤芍的活性化合物进行筛选[5]。以“赤芍”为关键词进行检索，得到赤芍的全部化学成分及靶点，再以口服生物利用度(oral bioavailabitity,OB)≥30%、类药性(drug-like,DL)≥0.18为条件筛选出赤芍的有效活性成分及其靶点[6]，使用Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)将获得的靶蛋白名称转换成Gene Symbol。

1.2 预测动脉粥样硬化的靶点在Gene Cards数据库(http：//www.genecards.org/)和OMIM数据库(http：//www.omim.org/)分别搜索关键词“atherosclerosis”，得出动脉粥样硬化的致病靶基因，再把两个数据库的检索结果合并，删除重复靶点，得到最终结果。

1.3 化合物靶点与疾病的交集将赤芍的有效靶点与动脉粥样硬化的靶基因相映射，通过R软件取交集获得“赤芍”治疗动脉粥样硬化的作用靶点。

1.4 构建中药调控网络及PPI网络根据以上结果，通过Cytoscape3.7.2软件构建“赤芍-有效成分-动脉粥样硬化-靶基因”的中药调控网络；运用STRING数据库(https：//string-db.org/)，将赤芍治疗动脉粥样硬化的靶点作为搜索关键词，研究物种限制为人，构建PPI网络，再应用R软件计算出连接节点最多的30个基因。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析首先将基因名字转化为基因ID，再运用Bioconductor生物信息软件包(http：//www.bioconductor.org/)、R软件，设定P≤0.05，Q≤0.05分别进行GO富集分析与KEGG通路分析。GO富集分析选取P值前10的条目制图，KEGG通路分析取P值前20的条目制图。

2 结果

2.1 赤芍有效成分及作用靶点TCMSP中赤芍化学成分共119个，根据条件筛选出有效成分29个(表1)，靶点681，其中有效靶点123个。疾病与药物靶基因取交集后共得到72个靶基因。

表1 赤芍的有效成分

2.2 中药调控网络运用Cytoscape软件构建“赤芍-有效成分-动脉粥样硬化-靶基因”的中药调控网络(图1)。

注：橙色-疾病；绿色-药物；蓝色-有效成分；黄色-靶基因图1 中药调控网络图

2.3 构建PPI网络将72个药物-疾病交集靶点通过STRING数据库进行蛋白相互作用的PPI网络分析(图2)。PPI中节点数为72个，相互作用连线共518条。用R软件计算出连接节点最多的30个基因及其连接节点的数目并制作柱状图(图3)。图3可知赤芍治疗动脉粥样硬化的核心基因是AKT1、FOS、IL6、JUN、VEGFA、CAT、CASP3、MMP9、PTGS2、CXCL8、ESR1、RELA、CYCS、AR、MMP2、CASP8、CDKN1A、HIF1A、CASP9、PGR。

2.4 GO富集分析GO富集分析分为分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组成(cellular component，CC)三个部分。其中MF富集结果中排名前10的有过氧化物酶活性、G蛋白偶联胺受体活性、抗氧化活性等(图4A)；BP富集结果中排名前10的有对脂多糖的应答、对细菌起源分子的应答、对类固醇激素的应答等(图4B)；CC富集结果中排名前10的有膜筏、膜微域、突触前膜的整体成分等(图4C)。

图2 蛋白相互作用的PPI网络

注：横坐标：连接的节点数目；纵坐标：靶基因图3 中药-疾病核心靶基因柱状图

A：MF分析；B：BP分析；C：CC分析图4 赤芍治疗动脉粥样硬化的网络GO富集分析

2.5 KEGG通路分析KEGG通路分析共得到130条信号通路(图5为Toll样受体信号通路)，根据校正后的P值进行排序，排名前20信号通路的P值及基因比率制成气泡图(图6)。结果显示赤芍主要通过参与乙型病毒性肝炎、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路等。

图5 Toll样受体信号通路图

图6 KEGG通路分析气泡图

3 讨论

本文对赤芍治疗冠状动脉粥样硬化的作用机制进行了网络药理学研究。中药调控网络显示，赤芍参与治疗动脉粥样硬化的有效成分是ellagic acid(鞣花酸)、paeoniflorin(芍药苷)、baicalein(黄芩素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、sitosterol(谷甾醇)、Spinasterol(菠菜甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、(+)-catechin(儿茶素)等12种。鞣花酸作为一种有效的抗动脉粥样硬化成分，可阻止促炎细胞因子的表达。当内皮细胞受到氧化型低密度脂蛋白(low densitylipid protein cholesterl，LDL-C)或白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)攻击时，可减少细胞黏附分子的表达并阻止NF-κB途径的激活[7-9]。研究发现，鞣花酸可减轻高脂血症家兔的氧化应激和动脉粥样硬化[10]；能改善高脂饮食小鼠的内皮功能障碍和动脉粥样硬化[11]。赤芍总苷具有抗凝血、抗血小板聚集及改善血液流变学异常的作用[12]。芍药苷通过阻断p38、ERK1/2/MAPK和NF-κB信号通路，阻滞细胞周期、抑制LDL-C诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移、减少炎性细胞因子的产生、抑制泡沫细胞的形成，减轻血管炎症[13]。黄芩素能抑制引起细胞凋亡的内皮炎症和氧化应激来保护血管内皮免受LDL-C引起的内皮功能障碍[14-15]。通过对ApoE缺乏的小鼠的研究证明，β-谷甾醇、菜籽醇和豆甾醇的混合物对动脉粥样硬化病变的发展、斑块的形成、泡沫细胞的形成和血管内皮损伤具有保护作用[15]。Stella等[16]研究表明，β-谷甾醇通过降低多种黏附分子的表达来抑制肿瘤坏死因子-α诱导的单核细胞(U937细胞)和人主动脉内皮细胞(HAECs)的黏附，从而证明了β-谷甾醇具有显著的抗动脉粥样硬化的潜力。一项包括1 160名男性和2 780名女性的基于中国社区的横断面的研究观察到植物甾醇摄入量与颈动脉内膜-中层厚度超声测量之间呈反向关系的趋势[17]。含有 β-谷甾醇和亚油酸乙酯的山药提取物可显著抑制动脉粥样硬化病变的发展；这种抗动脉粥样硬化作用与显著降低内膜增厚、血浆总胆固醇、LDL-C和C-反应蛋白(CRP)水平有关[18]。

KEGG通路分析显示主要信号通路有乙型病毒性肝炎、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、雌激素信号通路等。在对非活动期的乙肝病毒携带者的研究发现，血小板活化和动脉粥样硬化血栓形成的风险相对增加[19]。基于人群的队列研究显示，乙肝表面抗原阳性是颈动脉粥样硬化的一个独立于其他混杂危险因素的危险因素[20]。乙型肝炎与颅内动脉粥样硬化性狭窄的关系的多因素Logistic回归模型显示，乙肝核心抗体阳性且乙肝表面抗原阴性模式与颅内动脉粥样硬化性狭窄的风险增加有关[21]。AGE-RAGE信号是一个复杂而错综复杂的级联反应，已多种疾病中进行了研究。人类血管平滑肌细胞的研究显示，RAGE的激活增加了骨基质蛋白ALPmRNA表达，表明RAGE信号在血管钙化中发挥了作用[22]。有研究发现，即使在非糖尿病动脉粥样硬化疾病中也存在AGEs和炎性配体，但程度较小；在非糖尿病载脂蛋白E缺失的小鼠中测试了对RAGE缺失的影响时发现，即使在没有糖尿病的情况下，RAGE缺失也能减少动脉粥样硬化的病变面积和复杂性[23-24]。先天免疫系统的Toll样受体(TLR)与动脉粥样硬化病变的发生密切相关。Lundberg等[25]通过对TLR信号转接子缺陷的高胆固醇血症小鼠的研究，证明了敲除免疫细胞中的TRIF相关接头分子(TRAM)或含TIR结构域的接头诱导干扰素-β(TRIF)可减轻血管炎症和保护动脉粥样硬化。此外，发现TLR3是造血免疫细胞中的促动脉粥样硬化受体。通过对LDL-C受体缺陷小鼠实验发现，TLR4缺乏可减少动脉粥样硬化，证明了TLR4是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点[26]。对载脂蛋白E缺乏小鼠研究发现，刺激TLR7会导致急性血管损伤后内皮功能受损，并与促炎细胞因子的产生以及循环中内皮微粒和Sca1/Flk1阳性细胞的形成增加有关，而且长期使用TLR7的配体(R848)治疗的载脂蛋白E缺乏小鼠表现出动脉粥样硬化斑块的增加和主动脉组织中活性氧水平的升高，TLR7的激活能进一步诱导人冠状动脉内皮细胞凋亡和迁移受损[27]。Koulis等[28]证明TLR9在动脉粥样硬化中有保护作用，认为调节CD4+T细胞的细胞数量和炎症表型描述是其潜在的机制。已有研究证明雌激素可保护动脉粥样硬化病变的形成，并支持绝经前状态能为心脏提供保护的假设[29-30]。内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化斑块进展的一个重要因素。雌激素可通过抑制ERK磷酸化来抑制内皮细胞凋亡来延缓动脉粥样硬化进程[31]。有趣的是，雌激素对动脉粥样硬化的影响在不同年龄阶段是不同的。动脉粥样硬化与一氧化氮的生物利用度和(或)活性的降低有关[32]。而Laura等[33]观察到衰老改变了雌激素受体的表达比率和DNA甲基化水平对雌激素介导的一氧化氮生物利用度有不利影响，并提出其中一部分的机制是影响雌激素诱导一氧化氮合酶活性的上调和清除氧自由基的能力。

对动脉粥样硬化的治疗，中医有独特的优势和特色的诊疗方法，同时中药对于疾病的作用是多靶点且具有双向调节的作用，故其作用机制非常复杂，需要进一步的探索。网络药理学就是探讨药物对疾病多靶点的影响作用，故本研究基于网络药理学对赤芍治疗动脉粥样硬化的作用机制进行了初步研究，为以后的研究提供了一定的参考价值，但由于网络药理学自身的局限性和中药应用的复杂性，研究结果可能存在一定的偏差，仍需进一步临床验证。