过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

候怡谣，李霄，龙瑞才，杨青川，康俊梅，郭长虹

（1.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江省分子细胞与遗传育种重点实验室，黑龙江哈尔滨150000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

植物在生长发育过程中会遭遇到各种非生物胁迫，包括盐、干旱、低温等。在这些胁迫下，植物会产生一系列的生理和分子变化［1］。转录因子在这个过程中发挥着重要调控作用，它能特异性地结合下游靶基因启动子上的顺势作用元件，从而调控下游基因的表达并调节植物的耐受性［2-3］。植物中存在许多与非生物胁迫应答有关的转录因子，如：MYB、WRKY、bZIP、NAC、DREB等［4］。

含有同源异型域（homeodomain，HD）的转录因子与多种发育过程相关，HD由同源框（homeobox，HB）基因编码，HB基因最初是在果蝇中发现的，因其同源异型效应而命名，随着1991年在玉米（Zea mays）中首次发现HB基因Knotted-1之后，许多植物中的HB基因被分离出来［5-6］。同源异型域-亮氨酸拉链（HD-Zip）蛋白是HD转录因子超家族中的一类转录因子［5］，HD结构域和亮氨酸拉链（leucine zipper，LZ）元件紧密相连，HD负责与DNA的特异性结合，LZ使HD-Zip蛋白二聚，并且这两个结构域之间的联系是植物所特有的［7］。HD-Zip转录因子家族根据其成员的结构和功能被分为了HD-Zip I、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ4个亚家族［5］。其中HDZip I蛋白主要参与植物对非生物胁迫的响应［8］。例如在水分缺乏、渗透胁迫或外源ABA处理下，拟南芥（Arabidopsis thaliana）ATHB6基因的表达显著上调［9］，ATHB7和ATHB12在干旱和脱落酸（abscisic acid，ABA）条件下上调表达，并且可作为茎伸长的负调节因子，当在拟南芥中过表达ATHB7和ATHB12时，会出现与缺水条件下野生型拟南芥茎伸长降低一样的表型［10-12］。HD-ZipⅡ类基因的表达一般受光照条件的调控，参与植物的生长发育以及避阴反应［5］，如ATHB2/HAT4、HAT1、HAT2、HAT3和ATHB4受红光/远红光比值变化的调节，从而诱导大多数被子植物避阴［13］。HD-ZipⅢ类蛋白参与胚胎发生、分生组织形成、侧生器官发育、叶极性、维管系统发育和生长素的运输［5］，如REV、PHB、PHV、CNA和ATHB8基因调节胚后分生组织的形成［14］。HD-ZipⅣ类转录因子与表皮细胞分化、花青素积累、根发育以及毛状体的形成有关［5］，如GLABRA2（GL2）基因参与拟南芥毛状体的形态发育和成熟［15］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上广泛种植的豆科植物之一，因其产量高、品质好、适应性强而被誉为“牧草之王”［16］。干旱是影响植物生长发育的重要因素，严重影响了苜蓿的产量。因此，研究与干旱胁迫相关的基因在紫花苜蓿抗逆品种的培育中具有重要意义。本研究通过在拟南芥中过量表达MsHB7基因，并对转基因植株进行干旱处理，进而分析该基因在植物干旱胁迫过程中的功能，为将来紫花苜蓿抗旱育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的紫花苜蓿中苜一号（M.sativacv.Zhongmu-1）和拟南芥（Col-0，WT）均由实验室保存。植物材料种植于人工气候箱，培养条件为24/22℃（昼/夜），60%湿度，16 h光照/8 h黑暗。农杆菌GV3101购于华越洋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 紫花苜蓿MsHB7的克隆 以拟南芥ATHB7蛋白序列为参考，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中进行序列比对，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中找到一个同源基因（XM_003602273），根据该序列设计特异性引物MsHB7-F/R（表1），以中苜一号cDNA为模板，进行PCR扩增获得此基因的编码区序列，之后将其连接到pEASY-T5载体上并转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态中，之后经菌液PCR验证后测序。

1.2.2 生物信息学分析 通过ExPASy网站（http：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白质的等电点及分子量，NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白的保守结构域，利用DNAMAN软件与其他植物中的HD-Zip同源蛋白进行序列比对分析，用MEGA 7.0.14软件将目的蛋白与拟南芥中HD-Zip类蛋白进行进化分析（邻 接 法，neighbor-joining method）［17］。利 用Predict-Protein（https：//www.predictprotein.org/）网站进行亚细胞定位的预测。

1.2.3 表达分析 使用5%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）对在1/2 Hoagland营养液中生长4周的紫花苜蓿中苜一号进行干旱处理，并分别在处理0，1，2，4，8，12，24和48 h之后对紫花苜蓿的地上部分和根进行取材，提取总RNA，之后以Msactin2为内参基因，qMsactin2F/R和qMsHB7F/R分别为Msactin2和MsHB7的引物（表1），对MsHB7的相对表达量进行分析。

1.2.4 超表达载体pBI121-MsHB7的构建以及对拟南芥的转化 以pEASY-T5-MsHB7质粒为模板，含有XbaI和BamHI酶切位点的pMsHB7F/R（表1）为引物，进行PCR扩增，将扩增产物连接到pBI121表达载体上，获得pBI121-MsHB7重组质粒，并转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态中，测序之后提取质粒，转化到农杆菌GV3101中，利用花序侵染法［18］转化野生型拟南芥。

1.2.5 转基因拟南芥的筛选及转基因植株的检测 将收获的拟南芥T0代种子播种于含有卡那霉素（50 mg·L-1）抗性的1/2 MS固体培养基上，筛选出转基因拟南芥株系并使用引物MsHB7-F1/R1对这些株系进行PCR鉴定（表1），将阳性转基因植株进行保种并繁殖，直至获得T3代转基因植株，用于后续实验。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2.6 转基因拟南芥的干旱处理及耐旱性测定 将消毒之后的转基因拟南芥和野生型拟南芥种子种在1/2 MS培养基上，4℃春化3 d，于光照培养箱中培养14 d后，移至营养土和蛭石体积比为1∶1的营养基质中，一周后将植株分为两组，一组正常浇水作为对照，一组不浇水进行干旱处理，18 d后观察其表型变化并测定对照组和处理组植株的相对含水量，首先称取叶片0.2 g，记为Wf，之后将叶片浸入水中8 h，称其饱和鲜重Wt，再于105℃烘箱中杀青15 min，75℃条件下烘干至恒重，称干重，记为Wd，按照公式计算相对含水量：相对含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%。另外再分别取材，液氮速冻后于-80℃冰箱中保存，用于脯氨酸（proline，Pro）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定和抗逆相关指示基因的表达分析。采用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量，具体操作步骤为：称取约0.1 g组织，研磨后加入1 mL 3%磺基水杨酸，之后沸水浴提取10 min，12000 r·min-1离心10 min后取上清，冷却，同时将脯氨酸用蒸馏水稀释为20、15、10、8、6、4、2、1、0μg·mL-1，取0.25 mL提取液或脯氨酸溶液，加入0.25 mL冰乙酸与0.25 mL 2.5%酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷却后，加入0.5 mL甲苯，振荡30 s，静置片刻，然后吸取上层溶液于520 nm波长处比色，根据脯氨酸溶液建立标准曲线，以此计算样本脯氨酸含量，计算公式为脯氨酸含量（μg·g-1FW）=（C×V1）/（V2×W），其中，C为脯氨酸含量（μg）；V1为提取液总体积（mL）；V2为测定时所用提取液体积（mL）；W为样品鲜重（g）。丙二醛的测定步骤为：称取约0.1 g组织，研磨后加入1 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，12000 r·min-1离心10 min，取0.25 mL上清液加入0.25 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴15 min后冷却、离心，分别在450、532、600 nm波长下测定上清液的吸光值，计算公式：丙二醛含量（nmol·g-1FW）=［6.452×（A532-A600）-0.559×A450］×V1/（W×V2）［V1：提取液总体积（mL）；V2：测定时所用提取液体积（mL）；W：样品鲜重（g）］。

1.2.7 转基因拟南芥抗逆相关基因的表达分析 提取上述所取样品的总RNA并反转录为cDNA。通过qRT-PCR技术，以拟南芥ATactin7为内参基因，qATactin7F/R为内参基因引物（表1），检测转基因和野生型拟南芥中MsHB7基因及几个抗逆相关基因的表达量。

1.3 统计分析

利用Excel 2019对数据进行统计分析，采用单因素方差对荧光定量和生理指标进行差异显著性分析，采用GraphPad Prism 6作图。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿MsHB7的生物信息学分析

对获得的MsHB7基因序列（GenBank：MT508841）进行生物信息学分析，该基因包含一个738 bp的开放阅读框，可编码245个氨基酸，蛋白质的分子量为29020.17 Da，理论等电点5.33，含有两个结构域：同源异型域（41～91）和亮氨酸拉链结构域（93～131）。进化树分析结果表明，MsHB7与拟南芥第I类同源异型域-亮氨酸拉链蛋白聚为一类，并与拟南芥中的ATHB7和ATHB12亲缘关系较近（图1）。多重序列比对表明，MsHB7与其他植物中的同源蛋白都具有保守的同源异型框结构域序列和亮氨酸拉链结构域序列（图2）。亚细胞定位预测表明MsHB7定位于细胞核上。

图1 MsHB7与拟南芥中一些同源异型域-亮氨酸拉链蛋白进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of MsHB7 and some homeodomain-leucine zipper proteins from A.thalianaATHB7：NP_182191.1；ATHB12：NP_191748.1；ATHB20：NP_186771.1；ATHB5：NP_201334.1；ATHB6：NP_565536.1；PHV：NP_174337.1；ATHB8：NP_195014.1；ATHB15：NP_849795.1；PHB：NP_181018.1；REV：NP_200877.1；ATHB4：NP_182018.1；HAT3：NP_191598.1；HAT1：NP_193476.1；ATHB2：NP_193411.1；ATHB17：NP_178252.2；FWA：NP_567722.1；GL2：NP_001185443.1；PDF2：NP_567274.1；ANL2：NP_567183.2；HDG1：NP_191674.1.

2.2 干旱条件下MsHB7表达模式分析

对生长4周的紫花苜蓿中苜一号使用5%PEG模拟干旱处理，分别对处理0，1，2，4，8，12，24和48 h之后紫花苜蓿的地上部分和根的总RNA进行qRTPCR分析。结果显示：MsHB7基因在地上部分中随着处理时间的增加呈先上调然后下调的循环表达趋势，和地上部分的表达模式不同，在根中MsHB7基因的表达量在1和2 h下调表达，而后在4 h显著上调表达（图3）。

2.3 转MsHB7基因拟南芥的鉴定

利用花序侵染法转化野生型拟南芥植株，通过筛选之后获得6个转基因株系，对其中3个转基因株系（L1，L2和L6）进行PCR检测的结果显示，转基因株系均扩增出目的条带，而野生型拟南芥则未能扩出目的条带（图4）。利用qRT-PCR检测MsHB7基因在野生型和转基因拟南芥中的表达量，结果表明，MsHB7基因在转基因植株中成功表达，而在野生型拟南芥中没有检测到其表达（图5）。

图2 MsHB7与其他植物中同源异型域-亮氨酸拉链蛋白的氨基酸序列比对分析Fig.2 The amino acid sequence alignment analysis between MsHB7 and homeodomain-leucine zipper proteins from other plantsA：同源异型框结构域序列比对Sequence alignment of homeobox domain；B：亮氨酸拉链结构域序列比对，6个保守的亮氨酸残基用“L”表示Sequence alignment of leucine zipper domain，the six conserved leucine residues are represented by“L”.XP_003602321.2：蒺藜苜蓿M.truncatula ATHB-12；XP_004502719.1：鹰嘴豆Cicer arietinum ATHB-12-like；XP_017420762.1：小豆Vigna angularis ATHB-12-like；XP_016695089.1：陆地棉Gossypium hirsutum ATHB-12-like；XP_018842791.1：核桃Juglans regia ATHB-12-like；XP_002320889.1：毛果杨Populus trichocarpa ATHB-7；XP_018729630.1：巨桉Eucalyptus grandis ATHB-12-like；XP_007218213.1：桃树Prunus persica ATHB-12；XP_012088620.1：麻疯树Jatropha curcas ATHB-12；NP_001281285.1：苹 果Malus domestica ATHB-12-like；XP_016538252.1：辣 椒Capsicum annuum ATHB-12-like；NP_001311821.1 ATHB-12-like：烟草Nicotiana tabacum ATHB-12-like；XP_006491341.1：橙Citrus sinensis ATHB-7；XP_003548207.2：大豆Glycine max ATHB-12；XP_004230017.1：番茄Solanum lycopersicum ATHB-12；NP_191748.1：拟南芥A.thaliana ATHB-12.

2.4 干旱胁迫下转MsHB7基因拟南芥表型分析

将正常生长的拟南芥幼苗干旱处理18 d，3个转基因株系（L1，L2和L6）与WT相比，萎蔫得更为严重，而对照组并没有明显差异，说明紫花苜蓿MsHB7基因的异源表达降低了拟南芥对干旱的耐受性（图6）。

2.5 干旱胁迫下转MsHB7基因拟南芥生理指标分析

为了进一步研究转基因和野生型拟南芥的耐旱性，测定了干旱处理后转基因和野生型拟南芥的相对含水量、脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量。结果显示，干旱处理后，野生型拟南芥的相对含水量显著高于转基因型拟南芥，而脯氨酸和丙二醛含量显著低于转基因型拟南芥（图7）。

2.6 干旱胁迫下抗性相关基因的表达分析

为了研究MsHB7基因对其他抗逆调控相关基因的影响，本研究分析了ATCAT1、ATDREB2A、ATLEA3、ATRD29A这4个基因的表达水平。结果显示处理之后ATCAT1、ATDREB2A、ATRD29A在转基因中的表达水平明显高于野生型，而ATLEA3的表达水平明显低于野生型（图8）。

图3 紫花苜蓿在PEG处理下MsHB7基因的相对表达量分析Fig.3 Analysis of relative expression of MsHB7 gene in alfalfa treated with PEG*和**分别表示同一组织中不同时间点与0 h相比差异显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）。*and**respectively indicate that the difference between different time points in the same organization and 0 h is significant（P＜0.05）and extremely significant（P＜0.01）.

图4 MsHB7转基因拟南芥的PCR检测Fig.4 PCR identification of transgenic A.thaliana with MsHB7M：DNA分子量标准DNA marker；0：水ddH2O；-：阴性对照Negative control；+：阳性对照Positive control.

图5 转基因拟南芥中MsHB7的相对表达水平Fig.5 The relative expression level of MsHB7 in transgenic A.thaliana*表示转基因拟南芥与WT相比差异显著（P＜0.05）。*indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is significant（P＜0.05）.

图6 干旱胁迫下拟南芥表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of A.thaliana under drought stress

图7 干旱胁迫下拟南芥生理指标分析Fig.7 Analysis of physiological indexes of A.thaliana under drought stress*表示转基因拟南芥与WT相比差异显著（P＜0.05），**表示转基因拟南芥与WT相比差异极显著（P＜0.01）。下同。*indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is significant（P＜0.05）；**indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is extremely significant（P＜0.01）.The same below.

3 讨论

同源异型域-亮氨酸拉链（HD-Zip）蛋白是植物特有的一类转录因子，目前为止，已经从很多物种中鉴定出了HD-ZipⅠ类亚家族成员，如在拟南芥中鉴定了17个［19］，在玉米中鉴定17个［8］。已有研究表明，HD-ZipⅠ亚家族成员与重要的生理过程调控相关，包括植物的生长、发育、衰老以及对非生物和生物胁迫的响应［20］。本实验从紫花苜蓿中分离出了HD-ZipⅠ类亚家族中的一个成员MsHB7，进化树分析和多重序列比对表明MsHB7确实为HD-ZipⅠ亚家族中的一员，且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近，与其他转录因子一样，MsHB7定位在细胞核上［21-23］。有报道显示HD-ZipⅠ亚家族基因的表达受外界环境因素的调控，如干旱、极端温度和渗透胁迫等［5］，如拟南芥ATHB7基因的表达受缺水、渗透胁迫以及外源ABA的诱导［10］，ATHB12的表达受干旱和ABA诱导［11］，玉米干旱诱导基因Zmhdz10也受盐和ABA的诱导，且在不同的处理时间下表达量不同［24］。在本研究中，MsHB7基因在干旱条件下上调表达，并且地上部分和根中的表达模式存在差异，不同的时间点基因的表达量也不同，推测该基因在对干旱胁迫的响应中存在时间和空间的特异性。为了更好地了解MsHB7基因的功能，本研究利用花序侵染法进行转化，获得了MsHB7基因过量表达转基因拟南芥。

有研究表明HD-ZipⅠ转录因子的成员对非生物胁迫起着重要的调控作用，并且对植物耐受性的影响存在差异。其中，一些成员在植物抵御非生物胁迫过程中起正调控作用，如玉米Zmhdz10基因在水稻（Oryza sativa）和拟南芥中的过表达增加了植株对盐和干旱的耐受性［24］；鹰嘴豆CaHDZ12基因在烟草和鹰嘴豆中的过表达也使植株对干旱和盐胁迫的耐受性增强［20］。另外，还有一些HD-ZipⅠ转录因子家族的成员在植物抵御非生物胁迫过程中起负调控的作用，例如在拟南芥中过表达麻疯树JcHDZ07基因使转基因株系对盐胁迫更敏感［25］；水稻HD-ZipⅠ家族基因Oshox22的过表达使植株对干旱的耐受性降低，并且当Oshox22启动子区域被T-DNA插入突变后水稻的耐旱性增强［26］；紫花苜蓿MsHB2基因过表达拟南芥在NaCl和ABA胁迫下，生长被抑制，说明该基因在盐等非生物胁迫下对紫花苜蓿的抗逆性起负调控作用［27］。本研究中，将野生型和转基因拟南芥幼苗进行干旱处理18 d后发现，与野生型相比，转基因拟南芥萎蔫程度更明显，这表明在拟南芥幼苗中MsHB7基因可能对干旱胁迫起到了负调控的作用，从而降低了拟南芥的耐旱性，这与ATHB7和ATHB12负调控茎的生长类似［11-12］。

此外，本研究还测定了转基因株系和野生型拟南芥在干旱胁迫后的相对含水量，脯氨酸和丙二醛含量，以研究MsHB7过表达引起的生理生化变化。相对含水量能够反映植物组织的水分状况［28］，干旱处理后，转基因型和野生型拟南芥的相对含水量明显下降，而野生型拟南芥的相对含水量明显高于转基因型。在非生物胁迫下植物会被刺激产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），膜脂过氧化是活性氧造成的主要影响，一般通过测定丙二醛含量来检测膜脂过氧化［29］。本实验对拟南芥进行干旱处理之后，转基因型拟南芥较野生型积累了更多的丙二醛，这表明MsHB7过表达拟南芥在干旱后产生了更为严重的膜脂损伤。脯氨酸被认为是一种渗透保护剂，参与维持氧化还原平衡，活性氧解毒和保护蛋白质结构［30］。在干旱处理后，脯氨酸含量明显升高，与野生型相比，转基因拟南芥积累了更多的脯氨酸，推测这是由于干旱后MsHB7的过表达对转基因植株造成了更为严重的损伤，因此需要更多的脯氨酸来维持渗透平衡。

有研究表明，转基因植株中基因的过表达对不同的活性氧清除酶有不同的影响，例如在干旱胁迫下，ZjZFN1过表达植株中SOD，POD的表达水平下降，而APX的表达水平升高［31］；在本研究中，经干旱处理后转基因株系中ATCAT1的表达量与野生型相比显著上升。DREB2A蛋白属于Apetala2/乙烯响应元件结合因子（AP2/ERF）家族，具有耐盐性和抗旱性［32］，许多LEA蛋白是由低温、渗透胁迫和在营养组织中施加外源ABA诱导的，在拟南芥中DREB1A、DREB2A-CA的过表达或AREB1的激活引起一些LEA基因表达的上调，并且所有的这些转基因植物都提高了对干旱胁迫的耐受性，这些观察结果表明，LEA蛋白对水分的缺乏具有耐受性［33］。ATRD29A也被认为是逆境胁迫响应基因。研究表明，ATDREB2A和ATRD29A在转基因株系中的表达量明显高于野生型，而晚期胚胎发生丰富蛋白基因ATLEA3在转基因株系中的表达量则较野生型低。综上结果表明，MsHB7基因可能直接或间接地调节这些抗逆基因的表达水平，从而调节植物的耐旱性。

4 结论

生物信息学分析表明MsHB7转录因子属于第I类同源异型域-亮氨酸拉链蛋白且受干旱诱导。干旱处理18 d后，超表达MsHB7转基因拟南芥植株与野生型相比萎蔫程度更明显，野生型拟南芥的相对含水量要显著高于转基因株系，并且转基因株系积累了更多的脯氨酸和丙二醛。此外，在干旱处理之后，4个抗逆相关的基因中，ATCAT1、ATDREB2A和ATRD29A在转基因中的表达量明显升高，ATLEA3的表达量明显下降。干旱胁迫条件下，MsHB7转录因子在植物中可能起到了负调控的作用。