Macro-TSH测定在甲状腺疾病患者中的应用研究进展

师 帅，田晨曦，付言涛

(吉林大学中日联谊医院 甲状腺外科·吉林省外科转化医学重点实验室·吉林省甲状腺疾病防治工程实验室，吉林 长春130033)

检测血清中TSH和甲状腺激素的水平是评估甲状腺功能首选方式。患者血清TSH水平过高的常见因素有体重超标[1]、LT4治疗剂量不足、药物和食物的干扰[2]、胃肠道疾病[3]和妊娠[4]。除此之外，导致TSH测定值升高的罕见原因也包括人类抗小鼠抗体(HAMA)以及macro-TSH(M-tsh)[5]。关于M-tsh在一些亚甲减患者研究中均有报道，研究通过凝胶过滤色谱法(GFC)检测可知0.6%-1.6%亚甲减患者中存在M-tsh[6]，另外，日本学者Kadoya M首次在正常人的血液样本中检测到M-tsh的存在[7]。

1 Macro-TSH特征

M-tsh是由单分子TSH与其自身免疫性抗体(抗TSH抗体)共同组成的高分子聚合物，单分子TSH分子量约为30 kDa，易被肾脏过滤。然而当TSH与其抗体分子结合时会形成一个大于150 kDa的大分子M-tsh，大分子M-tsh不易被肾脏滤过，从而使得M-tsh在循环中积累，导致TSH测量值假性升高。在生物活性方面，M-tsh与高泌乳素血症中的Macro-PRL类似都被认为是无活性的大分子物质[8]。有研究发现，与单分子TSH相比M-tsh独有一种糖基化结构，这种结构的改变可能会影响患者睡眠质量[8]。在调节机制方面[8]，通过TRH刺激实验可发现M-tsh与游离TSH之间存在明显昼夜节律差异，正常情况下游离TSH浓度于清晨达到峰值，白天持续降低，夜晚升高。然而M-tsh浓度水平在白天与夜晚都可升高，这也是M-tsh影响睡眠的原因之一。另有研究还发现在一些新生儿中也检测到了M-tsh[9]，其原因是母体产生的抗TSH抗体通过胎盘进入胎儿体内形成M-tsh，从而影响新生儿甲功的判读。

2 Macro-TSH检测方法

目前，TSH常用的检测方式有免疫化学发光分析法(ICMA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)。然而这些免疫测定法不足之处在于不能完全区分游离TSH和M-tsh，从而干扰临床医师诊断。依据M-tsh为高分子聚合物这一结构特点，目前将GFC检测作为确诊M-tsh的金标准。因该技术操作复杂，成本较高并不适合大规模临床应用。除了GFC检测外，以下几种常见的实验室技术可以帮助临床医生检测M-tsh的存在。

2.1 聚乙二醇沉淀法

聚乙二醇(PEG)沉淀通常是用来筛查高泌乳素血症中是否存在macro-PRL，由于M-tsh与macro-PRL构成相似被用于M-tsh的筛查，根据Hattori[10]及相关文献报道使用最多的试剂为PEG6000。首先制备25%PEG6000的水溶液，然后将等量的0.2 mL血清样本分别添加到实验组0.2 mL的25%PEG6000溶液(TSH·PEG)和对照组0.2 mL的水(TSH·H2O)中，将样品混合离心测定上清液中TSH的浓度。最后计算(TSH·PEG)沉淀指数(%)=(血清TSH-沉淀后TSH)/血清TSH×100%。这种方法是目前筛查M-tsh最常用的方法[2]。Massimo使用PEG检测得知亚甲减患者中TSH沉淀指数为44.1%±3.9%；甲癌术后患者TSH沉淀指数为39.3%±1.9%，两者之间未见明显的差异(P=0.28)。Hattori关于亚甲减研究得出的沉淀指数为63%[11]。多数研究中把沉淀指数≥80%认为血清存在M-tsh。Massimo发现M-tsh的发生率为3.1%高于Hattori等其他报道的1.6%[12]、0.8%[6]、0.6%[13]，具体原因尚不清楚，可能是由于未排除HAMA导致其发生率、患病率较高。Loh TP使用PEG沉淀检测10名正常人得出沉淀指数为58%-79%[13]。除此之外还有一种M-tsh筛查指标即PEG沉淀后TSH的回收率(%)：[(TSH·PEG)/(TSH·H2O)]×100%，Francesca Mills[13]对TSH浓度>10 mU/L的495个样品均用25%PEG溶液处理，统计结果显示样品TSH回收率符合正态分布(P=0.049)，平均回收率为47%(SD=11.17%)，95%参考范围(平均值±2SD)为(25.6～69.4)%。因此当TSH回收率<25%考虑存在M-tsh。虽然PEG沉淀法可能会受HAMA、异噬性抗体、类风湿因子等物质干扰，但因此法操作简便仍是筛查M-tsh的最常用手段。总之对于可疑患者应采用PEG沉淀法筛查M-tsh，从而提高诊断水平和检验质量减少误诊和误治的可能。

2.2 凝胶过滤色谱法

GFC检测其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异进行分离，因此GFC试验是测定M-tsh的金标准。大分子M-tsh不能进入凝胶颗粒从而被洗脱；游离TSH单体能够进入凝胶颗粒中，由于不同蛋白在凝胶颗粒中停留的时间不同，导致分子量越大越早流出，最终将分子量不同的蛋白质分离。研究发现，对117例TSH回收率<25%的患者使用GFC检测发现有7例患者存在M-tsh[12]，另一组实验15例患者中有3例检测出M-tsh的存在[12]。因此研究发现GFC试验可进一步确认M-tsh是否存在。

2.3 加倍连续稀释法

稀释试验是检测内源性抗体的一种简单且有效的检测方法，并且使用现有的免疫检测平台即可完成。此法操作简单在大多数临床实验室可完成。其原理是将样本浓度连续稀释为原浓度的1/2、1/4和1/8，若存在内源性抗体，原本应该平行的浓度关系会被内源性抗体所打破。在一些关于M-tsh的病例报道中，也都有稀释试验的使用介绍。但也有学者认为稀释试验对于检出M-tsh的作用并不大，一些样本中存在的M-tsh并未被检出。因此稀释试验对于M-tsh的检测灵敏度并不高且并不能单独使用检测M-tsh。

2.4 混合试验法

混合试验法是将含有M-tsh的样品与常规甲减样品混合后，M-tsh样品中自身免疫性抗体将与甲减样品的过量游离TSH结合形成M-tsh，导致混合物中TSH回收率降低，但是此方法对于M-tsh的干扰诊断不敏感，可能存在其他与TSH结合物质从而影响检测结果，此法并不作为检测M-tsh的常用方法。除了上面的筛选方法，还有学者根据M-tsh存在明显糖基化结构使用蛋白质印迹以及色谱分析法。

3 M-tsh与甲状腺疾病

目前研究发现M-tsh主要是存在于亚甲减患者、部分甲状腺癌术后患者及少数正常人中。迄今为止Hattori等学者为M-tsh患病率的研究提供了大量数据，对681例亚甲减患者使用PEG法检测M-tsh，发现PEG-tsh的比值呈正态分布，范围为21.4%～100%，进一步对117例PEG-tsh>75%患者行GFC检测法进行确诊，最终有11例患者被证实存在M-tsh(1.62%)[11]。随后该团队将亚甲减患者数量扩大为1901名并且进一步排除了检测中HAMA的干扰，发现亚甲减患者中M-tsh的患病率降至0.8%[6]，此外，Mills等也报道了相似的患病率(0.6%)[13]。通过研究发现，对于TSH>10 μL的亚甲减患者首先可用PEG法进行筛选，然后使用GFC法进一步证实M-tsh的存在。由于M-tsh在亚甲减患者中并不少见，检测M-tsh对于亚甲减患者来说具有重要的临床意义，因为它可能会改变亚甲减患者的诊疗方案。除此之外，有学者[11]按照患者甲状腺术后病理结果将其分为：恶性肿瘤(实验组)73例，良性肿瘤(对照组)24例。使用PEG法分别检测各组的PEG-TSH，得出实验组PEG-TSH为39.3%±1.9%；对照组为44.1%±3.9%(P=0.28)，仅有1名实验组和2名对照组的患者检测出存在M-tsh。研究仅得出在实验组中PEG-TSH的比率与FT4呈负相关，M-tsh在两组间差异未见明显统计学意义，M-tsh的存在与疾病良恶性无关，此外M-tsh与患者的年龄、性别、TgAb测定、疾病分期以及有无放射碘治疗史都无明显相关性。Giusti M认为这种结果可能与样本量较少有关，并且认为极少能够在病人中检测出M-tsh，对于可疑存在M-tsh的患者需长期随访。另外学者Kadoya M使用PEG法以及GFC法对TSH水平正常患者进行检测，并证实了M-tsh的存在，此研究结果印证了一重要观点，即使是在TSH水平正常的人群中也有可能存在M-tsh。甲状腺疾病患者中部分需长期服用LT4治疗甲状腺疾病。虽然目前M-tsh的临床意义尚不清楚。但是对于存在M-tsh的甲状腺癌术后患者应建议适当减少LT4的剂量，避免因假性TSH升高造成外源性高甲状腺素血症。对于亚甲减患者也需要警惕M-tsh的存在，一些专家认为由于M-tsh的存在使得亚甲减的发病率可能被高估，尤其是TSH水平异常升高且对LT4替代无反应的亚临床甲减患者，应警惕是否存在M-tsh以避免不必要的治疗。由于M-tsh可长时间存在患者体内，所以对于已明确存在M-tsh患者需进行长期随访。

4 M-tsh与其他疾病

通常人们仅仅把甲状腺功能减退和亚甲减作为睡眠呼吸暂停综合征的危险因素[7]。 但是从未研究过患者睡眠质量的差异与M-tsh的存在是否相关。 对此Manabu通过对日本兵库县314名冠心病患者睡眠质量的研究，首次证明了M-tsh可影响患者睡眠质量。研究发现M-tsh可能来自于垂体结节部，并且通过视交叉上核接受褪黑素的调节控制，从而打乱患者生物节律影响其睡眠质量。因此，M-tsh似乎是一种新的监测人类睡眠质量的标志物，这项研究结论为生理学提供了重要信息，并在神经内分泌学领域开辟了新的研究方向。此外有相关报道指出，当母体中存在M-tsh时，其体内的抗TSH抗体可从母体内垂直传播至胎儿体内，从而导致新生儿甲功检测异常表现为甲状腺功能亢进[9]，对于这种情况应首先检测母体内是否存在M-tsh，从而减少由M-tsh干扰导致的误诊。

5 小结

综上所述，当患者的TSH大幅度升高与其临床表现不一致时，应该考虑M-tsh的存在。目前M-tsh检测方法较多且各有特点，其中PEG沉淀法已成为M-tsh最常用的筛查方法，虽然此法最常用但是在检测中仍受到一些限制。GFC法可进一步明确M-tsh的存在，此法是目前检测M-tsh的金标准。目前M-tsh主要是存在于亚甲减患者、部分甲状腺癌术后患者及少数正常人中，且M-tsh的存在率极低，但是M-tsh的存在会影响患者的诊疗及其生活质量，因此凡是怀疑存在M-tsh的患者必须长期随访，及时发现M-tsh的存在，才能避免误诊，减少药物不良反应，提高患者生活质量。目前关于M-tsh的研究相对较少，检测技术以及临床意义尚需多中心进一步的研究来证实。