荧光定量PCR方法检测鸭疫里默氏菌在组织中的分布规律

陶志云，徐文娟，施祖灏，朱春红，章双杰，宋卫涛，刘宏祥，李慧芳*

(1. 江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州，225125；2. 谱尼测试集团江苏有限公司，江苏 苏州，215000)

鸭疫里默氏菌病是侵害水禽和其它鸟类的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病及死亡率高，急性病变多以死亡为转归，慢性病例多会耐过，但会失去经济价值[1-3]，因此，该病已成为危害水禽养殖业的一种重要传染病。目前，鸭疫里默氏菌病的临床诊断主要的方法是血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规PCR检测等。由于鸭疫里默氏菌血清学众多，目前已报道的有21种血清型[4-7]，检测难度较大。SYBRGreen I实时荧光定量PCR使用特异性引物和SYBR Green I核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，无需电泳，以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测[8-10]。本研究建立一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，根据鸭疫里默氏菌16S rRNA保守序列设计特异性引物，经优化反应体系和条件，建立检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，并将该方法用于鸭疫里默氏菌感染后在组织中分布检测，为鸭疫里默氏菌感染机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株培养 试验所用鸭疫里默氏菌菌株为ATCC11845标准株，菌株购自北京北纳创联生物技术研究院。冻存的菌株经活化后挑取单克隆，加入5 mL含5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，37 ℃摇床中过夜培养，取2 mL菌液加入到200 mL的含有5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，继续37 ℃摇床中过夜培养。将所得菌液1 000 rpm/min离心10 min后去上清，用生理盐水将沉淀稀释为4×106，4×107，4×108，4×109，4×1010，4×1011cfu/mL，备用。

1.1.2 试验鸭 试验鸭来源于高邮鸭集团，为健康雏鸭，相同饲养条件下饲养至30日龄时进行分组。

1.1.3 鸭疫里默氏菌人工感染试验及样品采集 每只鸭皮下注射0.5 mL菌液，对照组鸭注射相同剂量的生理盐水，每组15只，人工感染后连续观察14 d，统计死亡率，计算半数致死量，确定适宜的感染剂量。

采用1×109cfu/mL的鸭疫里默氏菌人工感染健康的30日龄育成期高邮鸭150只，按照该品种鸭国家标准要求饲养，随机分为2组(对照组和感染组)，在感染的1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d，屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑组织，分别用冻存管储存于液氮中，用于细菌RNA提取。

1.2 主要试剂与仪器

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(HB4114，青岛海博生物有限公司)，血平皿(9 cm，YB3400071，上海钰博生物科技有限公司)，国产血清(四季青，11011-8611，北京索莱宝科技有限公司)，TRIzol-A+总RNA提取试剂(DP421)、RealUniversal彩色荧光定量预混试剂(SYBR Green，FP201，天根生化科技(北京)有限公司)、FastKing一步法除基因组cDNA 第一链合成预混试剂(KR118，天根生化科技(北京)有限公司)、pGM-T克隆试剂盒(VT302-02，天根生化科技(北京)有限公司)、无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118，天根生化科技(北京)有限公司)、Universal DNA纯化回收试剂盒(DP214，天跟生化科技(北京)有限公司)。高速冷冻离心机(Eppendorf centrifuge 5417R)，紫外分光光度计(GeneQuant II Pharmacia Biotech)，PCR仪(Eppendorf mastercycler)，凝胶成像系统(Tanon 3500R)，荧光定量PCR仪(Stratagene Mx3000P)。

1.3 试验方法

1.3.1 RNA提取和质量检测 按照TRNzol-A+总RNA提取试剂说明书提取组织总RNA，用适量RNA-free水溶解提取的RNA沉淀，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA的纯度和含量。

1.3.2 cDNA第一链的合成 参照FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成试剂盒说明书将提取的总RNA逆转录成cDNA，反应体系为：模板RNA 1 μg，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，加水至20 μL。逆转录反应条件为：42 ℃ 孵育15 min，95 ℃孵育3 min，反应结束后取出逆转录产物置冰上进行后续试验或冷冻保存。

1.3.2 引物设计、目的片段克隆及标准质粒制备 根据鸭疫里默氏菌16S rRNA基因信息(GenBank登录号为：NR_026025.1)，运用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对。上游引物序列F: 5'-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3'，下游引物序列R: 5'-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3'，目的序列长度约163 bp。PCR反应体系总体积20 μL，PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35个循环)；72 ℃ 10 min。扩增获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化试剂盒回收纯化后按pGM-T载体试剂盒说明书连接过夜，将连接产物转化入TOP10感受态细胞，涂板后置于37 ℃生化培养箱过夜培养，挑取转化子于含氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃ 摇床180 r/min振摇培养过夜，菌液PCR鉴定目的片段是否连接到质粒中。将鉴定正确的质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.3.3 荧光定量PCR反应 SYBR Green I法进行荧光定量PCR扩增，20 μL反应体系为：cDNA 2 μL，2×RealUniversal PreMix 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。荧光定量PCR反应条件为：① 95 ℃ 15min；② 95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40个循环；③ 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，同时设阴性对照，每个样品重复3次。

1.3.4 标准曲线的建立 将测序验证正确的含鸭疫里默氏菌16S rRNA基因的质粒，用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取阳性质粒，用分光光度计测其浓度后，做10倍梯度稀释，以10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8浓度质粒作为模板，进行荧光定量PCR反应，反应条件同上，设置3个重复，建立标准曲线。

1.3.5 数据处理和统计分析 标准质粒拷贝数(copies/μL)=标准质粒浓度/标准质粒分子量×6×1014，其中，标准质粒分子量=标准质粒碱基数×324。根据得到的标准曲线方程，将得到的未知样本的Ct值代入线性方程即可计算出待测样品中鸭疫里默氏菌的含量。

2 结果与分析

2.1 不同剂量鸭疫里默氏菌人工感染的死亡率

试验设置了2×106，2×107，2×108，2×109，2×1010，2×1011cfu/只 6个浓度梯度，记录死亡情况，见表1。采用累计法(Reed-Muench法)计算LD50，死亡率每增加一个百分点，剂量对数增加：(11.301-10.301)/(86.667-46.667)=0.025，死亡率从46.67%增加到86.67%，剂量对数增加0.025×(50-46.667)=0.075，LogLD50=10.301+0.075=10.386，取反对数，LD50为2.432×1010。

表1 人工感染鸭疫里默氏菌剂量及死亡情况Table 1 The dose and mortality of Riemerella anatipestifer infection

2.2 鸭疫里默氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

2.2.1 荧光定量PCR产物检测 经琼脂糖凝胶检测，荧光定量PCR扩增产物(图1A)和含有质粒的菌液PCR扩增后产物(图1B)，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段长度约163 bp(见图1)。

图1 16S rRNA基因片段PCR扩增图

2.2.2 荧光定量PCR熔解曲线、扩增曲线和标准曲线 由图2A可见，鸭疫里默氏菌16S rRNA基因的标准品质粒经10倍梯度稀释，定量PCR反应后获得的熔解曲线峰形单一，无杂峰；图2B的扩增曲线为S形，图2C的标准曲线的拟合度(R2)为0.997，将标准品和样本在同一试验中运行，得到标准曲线方程：Y=-3.319×LOG(X)+33.83。

图2 鸭疫里默氏菌16S rRNA基因扩增的熔解曲线(A)，扩增曲线(B)，标准曲线(C)Fig.2 Melting curve (A), Amplification curve (B) and standard curve (C) of Riemerella anatipestifer 16S rRNA gene

2.3 鸭疫里默氏菌在鸭组织中的分布规律

采用建立的荧光定量PCR方法，对鸭疫里默氏菌感染后1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d的脾脏，脑，心脏，肺脏，肝脏中的载菌量进行了检测，见表2。结果表明在人工感染后1 d，几种组织中均有鸭疫里默氏菌定殖，在2 d时显著增加，达高峰，3 d时细菌定殖量快速下降，但在心脏和脑中仍检测到大量细菌定殖，5 d后细菌定殖大幅减少，在肺和肝中未检测到，但在脑中仍有大量细菌定殖。

表2 鸭疫里默氏菌人工感染后不同组织中的载菌量Table 2 Amount of bacteria in tissues during Riemerella anatipestifer infection

3 讨 论

目前已有较多鸭疫里默氏菌人工感染试验的报道，如，I型鸭疫里默氏杆菌菌株人工感染试验中，采用2×108cfu/只经嗉囊和气管注射感染途径感染1周龄的雏鸭，成功建立了鸭疫里默氏菌人工感染模型[11]；用3×109cfu/只经颈部皮下注射13日龄的天府肉鸭进行人工感染试验[12]；用2×108cfu/只经腿部皮下注射10日龄四川麻鸭，在接种后168 h内发病率80%[13]。以上试验表明，由于鸭疫里默氏菌菌株、感染途径、鸭的品种和日龄等的不同，感染剂量也不同，应针对不同的菌株和试验动物摸索适宜的感染剂量。因此，本文通过皮下注射，设置了鸭疫里默氏菌ATCC11845标准株的不同感染剂量感染30日龄高邮鸭试验，确立了鸭疫里默氏菌的LD50为2.432×1010cfu/只。为了达到好的感染效果，同时减少病死率，选择1×109cfu/只为后续试验的人工感染剂量。

SYBRGreen I荧光定量PCR法以无需电泳，速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测[14-16]。本试验中所设计引物经PCR扩增后可获得单一的清晰条带，经测序和BLAST比对与相应的目的基因的一致性达到100%，说明所设计的引物正确。实时荧光定量PCR扩增的熔解曲线可以看出，扩增产物在熔解温度上为一特异性的单峰，无其它杂峰，说明该引物的特异性强，可以准确定量。扩增曲线为“s”形，符合实时荧光定量PCR的要求。一般认为当R2>0.98时，所建立的荧光定量反应才更加可靠和稳定[17]。本试验中16S rRNA基因的荧光定量PCR反应相关系数为0.997，说明所建立的该基因的荧光定量PCR方法稳定可靠。

已有研究表明，在自然感染的病例中，鸭心、肝、脑三种组织中荷载量由高到低依次为脑，心，肝[18]。本文对人工感染鸭疫里默氏菌后在组织中的分布情况做了分析，结果表明组织中的鸭疫里默氏菌载菌量由高到低依次为脑，心，脾，肺，肝，该结果与自然感染结果一致。进一步对鸭疫里默氏菌感染的时间特征做了分析，表明鸭疫里默氏菌在几种组织中均在感染后2 d达定殖高峰，这与临床观察的感染后2 d临床症状最为严重相一致。在感染的1 d到14 d在脑中均可检测到鸭疫里默氏菌，这与鸭疫里默氏菌感染可引起站立不稳，头颈震颤，角弓反张，抽搐等脑神经症状相符，明确了鸭疫里默氏菌可以突破脑屏障，引起脑损伤。感染后5 d，鸭疫里默氏菌在脾脏，心，肺，肝中的载菌量很少或检测不到，这说明在5 d时，由于机体的抗感染免疫作用，鸭疫里默氏菌大幅减少。