人参皂苷Rg1抗长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的作用研究

周桃花 周红艳 陈芳 尹颖 杨玉

[摘要]目的：观察人参皂苷Rg1抗长波紫外线（Ultravio1et A，UVA）对人皮肤成纤维细胞（Human dermal fibroblasts，HDF）的损伤作用，为研究开发光老化防护剂提供依据。方法：分离HDF进行原代培养及冻存;复苏HDF传代培养至第6～8代用于样品活性检测;采用改良MTT法检测UVA照射前后给予人参皂苷Rg1 HDF存活率的变化情况，用维生素C作阳性对照。结果：在照射前24h预先给予人参皂苷单体Rg1，在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率较模型组明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）;且5、10μg/ml组的细胞存活率优于阳性对照组（P<0.05）。照射后给予人参皂苷单体Rg1，在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率均较模型组明显提高（P<0.05）。结论：人参皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范围内对HDF的UVA损伤有较好的预防和治疗作用。

[关键词]人参皂苷Rg1;人皮肤成纤维细胞;长波紫外线;光老化;预防;治疗

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）03-0090-03

An Experimental Study on the Effects of Ginsenoside Rg1 on the Injury Model of Human Dermal Fibroblasts Induced by UVA

ZHOU Tao-hua，ZHOU Hong-yan，CHEN Fang，YIN Ying，YANG Yu

（Department of Pharmacy，Sichuan Provincial Hospital for Women and Children，Affiliated Women and Children's Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610041，Sichuan，China）

Abstract： Objective  T0 observe the anti-damage effect of ginsenoside Rg1 against ultraviolet A （UVA） on human dermal fibroblasts （HDF）， and provide a basis for the research and development of photo aging protection agents. Methods  Isolated HDF for primary culture and cryopreservation. Resuscitated HDF subculture to the 6th to 8th generation for sample activity detection. Utilizing the modified MTT method to detect the survival rate of HDF before and after UVA irradiation when treatment with ginsenoside Rg1， and vitamin C was used as a positive control. Results  The ginsenoside monomer Rg1 was pre-administered 24h before irradiation， the cell survival rate was significantly improved compared with the model group at a concentration of 2.5-40μg/ml， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the cell survival rate of 5， 10μg/ml group was better than vitamin C group（P<0.05）. The ginsenoside Rg1 was given after irradiation， the cell survival rate at the concentration of 2.5-40μg/ml was significantly higher than those of the model group （P<0.05）. Conclusion  Ginsenoside Rg1 has a good preventive and therapeutic effect on the UVA damage ofHDF in the range of 2.5-40μg/ml.

Key words： ginsenoside Rg1; human dermal fibroblasts; ultraviolet A; photoaging; preventive activity; therapeutic effect

皮膚是直接与外界接触的器官，最易受外界环境的影响。日光照射可使皮肤出现粗糙﹑松弛﹑皱纹加深加粗﹑不规则性色素沉着﹑毛细血管扩张﹑角化不良等光老化现象[1-2]，不仅有损于人体外部形象，而且可并发多种皮肤病，影响人们的生活质量。日光中引起光老化的成分主要是中波紫外线（Ultraviolet B，UVB）和UVA，UVB大部分穿透表皮而被吸收，少部分可到达真皮层，是造成皮肤损伤的主要原因之一，但能被衣服﹑帽子﹑玻璃阻断。UVA能穿透表皮到达真皮造成皮肤内真皮的主体细胞成纤维细胞损伤。皮肤光老化本质是自由基产生与抗氧化作用的降低[3-4]，故寻找稳定的抗氧化剂，成为防治皮肤光老化的重要思路。至今为止，人们已从三七、人参植物中分离出很多种人参皂苷单体[5]，人参皂苷Rg1是三七和人参最主要的活性成分[6]，不仅含量高而且清除氧自由基效果也是人参皂苷之首，具有抑制细胞质过氧化反应;清除自由基的能力;还可以使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性增加[7-9]。前期研究表明，可以用紫外线照射体外培养的人体皮肤细胞来建立紫外线光老化模型[10-11]。本实验在成功建立UVA辐射损伤HDF模型上，研究人参皂苷Rg1抗UVA辐射对HDF损伤模型的作用，探讨人参皂苷Rg1抗皮肤光损伤的预防和治疗作用，为研发皮肤光老化天然产物防护剂提供依据。

1  材料和方法

1.1 材料：人皮肤成纤维细胞（Human dermal fibroblasts，HDF）来自健康男性包皮环切术时的包皮两块，每块约2cm×2cm。

1.2 样品、试剂与仪器：人参皂苷Rg1标准品购自中国藥品生物制品检定所，含量97.7%，浅棕色粉末，室温下水溶性良好，无沉淀﹑残渣析出﹑溶液呈浅棕色。维生素C、H-DMEM培养基、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲基四氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）等。CO2培养箱、长波紫外线灯管、UVA双通道紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂制造）等。

1.3 实验方法

1.3.1 样品及阳性药物配制：用生理盐水配制成0.8mg/ml的人参皂苷Rg1储存液，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后，维生素C用PBS缓冲液将维生素C粉剂配制成0.6mg/ml的储存液，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后，分别装于1ml离心管内并在-20℃保存。加药前用PBS缓冲液将储存液稀释为受试浓度，每次加药前临时配制。

1.3.2 细胞培养：取健康男性包皮环切术时的包皮，参照文献[12]分离培养HDF，培养至第3代冻存，根据实验进程需求对HDF解冻复苏，培养细胞至第6～8代用于实验。

1.3.3 UVA损伤HDF体外模型的建立：将培养好的HDF弃去培养基，PBS缓冲液漂洗两次后，加入适量PBS缓冲液后进行UVA照射，UVA照射强度为5mW/cm2，照射时间40min，照射剂量为12J/cm2。置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h。

1.3.4 人参皂苷Rg1抗UVA对HDF损伤作用：实验每组均设6个平行孔，每块板设3个调零孔（只加DMEM基础培养基），用于酶标仪检测调零。正常对照组：加入DMEM基础培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h后超净台放置40min;模型组：加入DMEM基础培养基;给药组：给药方式为提前给药，加入梯度浓度依次为2.5、5、10、20、40μg/ml人参皂苷Rg1;阳性对照组（维生素C）：提前给药，加入浓度为6μg/ml的维生素C，然后将模型组、给药组、阳性对照组置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h后进行UVA照射，照射方式同模型组。照射完毕，将以上各组DMEM培养基更换后置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24h。同理用相同的方法把给药组和维生素C组的先给药后照射变为照射后立即给药，其他条件不变进行试验。

1.3.5 改良MTT法检测细胞活率：加入MTT（5mg/ml）10微升/孔;继续培养4h后，加入三联液100微升/孔;继续在37℃培养12h，用酶标仪在570nm﹑630nm双波长下测定每个孔的OD值（实验重复三次）。

1.3.6 细胞相对存活率按下式计算：OD值=实测吸光度-空白吸光度;相对存活率（%）=样品孔OD值或模型孔OD值/正常对照孔OD值

1.3.7 统计学分析：所有计量资料数据先行方差齐性检验后，采用多样本均数单因素方差分析（ANOVA）法，应用SPSS 12.0统计软件分析数据结果。

2  结果

2.1 大体观察：UVA模型组HDF的数量明显比正常对照组减少，细胞体积变大、细胞内颗粒增多、出现慢性光损伤表型。维生素C组HDF数量比模型组增多，加人参皂苷Rg1后照射组和照射后加人参皂苷Rg1组HDF数量最多（见图1）。

2.2 加人参皂苷Rg1后照射组的HDF存活率：给药方式为提前给药，加入不同浓度的人参皂苷Rg1继续培养24h后进行UVA照射，MTT法检测细胞存活情况，从表1中可以看出，照射后模型组HDF的存活率从100.0%下降到46.17%，差异具有统计学意义（P<0.01）;阳性对照组细胞存活率为75.58%，较模型组增加29.41%，差异有统计学意义（P<0.05）。提前24h加入Rg1浓度2.5、5、10、20、40μg/ml，细胞存活率与模型组比较分别提高了45.25%、70.79%、63.61%、45.64%、53.50%，差异具有统计学意义（P<0.05）。Rg1在2.5μg/ml就显示出保护作用，在5μg/ml时保护作用达到高峰，继续提高浓度至10～40μg/ml时保护作用不再增加。其中5、10μg/ml的细胞存活率与阳性对照比较分别提高了41.38%、34.20%，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 照射后加人参皂苷Rg1组的HDF存活率：给药方式为照射后立即给药，UVA照射完毕后立即加入不同浓度的Rg1继续培养24h后用MTT法检测细胞存活情况，从表2中可以看出，照射后模型组HDF的存活率从100.00%下降到12.37%，差异有统计学意义（P<0.05）。阳性对照组能使细胞存活率得到一定程度的改善，存活率较模型组增加76.93%（P<0.05）。照射后立即加入人参皂苷Rg1 2.5、5、10、20、40μg/ml，细胞存活率与模型组比较分别提高了76.15%、106.13%.、103.09%、95.48%、82.95%，差异具有统计学意义（P<0.05）。Rg1在2.5μg/ml就显示出保护作用，在5μg/ml时保护作用达到高峰，继续提高浓度至10～40μg/ml时保护作用不再增加。以上结果说明人参皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范围内对HDF的UVA损伤有较好的预防和治疗作用。

3  讨论

本研究根据前期摸索出HDF的细胞密度、照射强度建立HDF光老化模型用于人参皂苷Rg1样品的筛选，用一定剂量的UVA照射HDF后，细胞数量减少、体积变大，细胞内颗粒增多（见图1），细胞存活率下降（见表1～2），与文献[10，13]报道结果一致，从每一次照射结果来看，均达到了一定强度的细胞损伤，加入维生素C后，细胞存活率提高，说明成功建立了UVA辐射损伤HDF的模型。为了证明模型的有效性，本研究选用了作用确切，作用机制与受试样品相近，临床常用的维生素C作为阳性对照，采用高纯度的Rg1样品进行研究可排除样本中杂质的干扰，能更加准确地反映待测样品的活性。在研究中还发现在2.5～10μg/ml范围内受试样品均已显现出一定的预防和治疗作用，继续提高浓度至10～40μg/ml时保护作用不再增加，因此在后续实验中可以降低浓度进行测试。从理论上说抗光老化产品的预防作用应该优于治疗作用，但在本试验中，还难以做出这一结论，今后还要另外设计试验体系来对样品的预防和治疗作用进行比较。

近年来，国内外对天然药物防治皮肤光损伤开展了研究，并取得了一定进展。李丹晖[14]研究人参皂苷对皮肤细胞紫外线损伤的保护作用中发现人参皂苷Rg1对UVB致人皮肤成纤维细胞的损伤具有一定保护作用，其机制可能与他的抗氧化作用和促进细胞增殖作用有关。刘勇[15]等研究了人参皂苷Rg1保护UVB所致皮肤成纤维细胞急性损伤，发现人参皂苷Rg1通过增强细胞的抗氧化能力和降低基质金属蛋白酶-1及-3的生成，从而发挥保护细胞的作用。本研究发现，UVA照射形成的HDF损伤模型中，加入人参皂苷Rg1细胞存活率增加，说明人参皂苷Rg1在2.5～40μg/ml浓度范围内对HDF的UVA辐射损伤模型有较好的预防和治疗作用。这种作用的机理是否与促细胞增殖有关呢？仍需更进一步深入探讨研究。

皮肤光老化一直是当今护肤品界研究的热门课题。植物系护肤品的成分稳定、可以改善肌肤活力与弹性，而且能够最大程度避免化学刺激等遗留问题，然而可应用于抗皮肤光老化的中药及其提取物少之又少，人参皂苷Rg1在人参、三七等多种物质里广泛存在，通过工艺改良后提取得到率高。随着我国生活水平逐年提高，越来越多的女性更倾向于纯植物护肤品使用，可以通过深入研究，开发出功效更为突出的皮肤光老化纯天然产物化妆品，有广阔的发展空间与市场前景。

我国高原和低纬度地区太阳紫外光辐射较强，人们在生产生活中深受紫外光毒害致皮肤光老化现象非常普遍，该地区皮肤病患者相对增多，相当部分患者从皮肤溃烂到异常增殖癌病转化趋势明显。随着对紫外线导致皮肤损伤的深入研究表明人参皂苷Rg1对皮肤成纤维细胞光老化有预防和治疗作用，增加了皮肤病预防和临床治疗药物开发途径。

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[收稿日期]2020-03-06

本文引用格式：周桃花，周红艳，陈芳，等.人参皂苷Rg1抗长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的作用研究[J].中国美容医学，2021，30（3）：90-93.