预处理对蓝莓NFC果汁品质和风味的影响

刘 伟，许 弯，胡小琴，胡梓妍，李高阳，张菊华*

（1 湖南省农业科学院农产品加工研究所 长沙410125 2 湖南大学研究生院隆平分院 长沙410125）

蓝莓果实营养丰富，富含黄酮、花青素和VC等，因其具有潜在的抗癌、抗衰老以及预防心脏病等保健功能而深受消费者欢迎[1]。花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物[2]。花青素对改善记忆有较好效果。例如：Adrian 等[3]研究表明采用急性富含类黄酮的蓝莓饮品干预，学龄儿童更能有效地编码记忆项目。Guo 等[4]研究表明蓝莓饮料对慢性轻度压力导致认知障碍的成年大鼠具有保护作用。

蓝莓果汁加工是目前最主要的蓝莓加工方法。NFC 果汁即非浓缩还原果汁（Not-From-Concentrate，缩写为NFC），是采用新鲜水果直接榨汁所得100%纯鲜果汁。国外蓝莓NFC 果汁的研究主要集中在蓝莓汁营养和功能活性评价、杀菌方式对品质的影响等方面。Barba 等[5]研究了超高压和脉冲电场处理后蓝莓汁4 ℃冷藏过程的品质变化。Reque 等[6]研究了蓝莓全果汁4 ℃冷藏花青素稳定性和抗氧化活力。Bett-Garber 等[7]研究了蓝莓汁的糖、酸、花青素和抗氧化能力等与风味的相关性。蓝莓果实富含果胶等黏性物质，影响出汁率和果汁品质，且蓝莓果汁加工中易由多酚氧化酶（polyphenol，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）引发严重的酶促褐变，因此酶促褐变控制和酶解液化等预处理对NFC 果汁品质至关重要。国内果浆酶解研究集中在酶解条件[8-12]、蓝莓汁酶促褐变控制（如蒸汽热烫[13]、抑制剂处理[14]）等方面。有关蓝莓酶促褐变的抑制研究未全面评价热烫处理对蓝莓品质的影响，果浆酶解缺乏高效酶制剂的筛选及酶解前、后的出汁率、可溶性固形物、花色苷含量及挥发性香气成分的系统评价。本文开展热烫处理钝酶、高效酶制剂筛选制汁等预处理加工对NFC 蓝莓汁品质的影响研究，以期为研发高品质蓝莓NFC 果汁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为成熟的粉蓝 （兔眼蓝莓一号）果实，采自湖南省长沙县路口镇的星城明月生态农业科技发展有限公司的蓝莓基地。

1.2 仪器、设备及试剂

1.2.1 仪器、设备 紫外分光光度计（UV-1800），日本Shimadzu 仪器有限公司；冷冻离心机（Avanti J-26XP），美国贝克曼库尔特有限公司；电子天平（AL204），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；组织捣碎匀浆机（JJ-2），常州国华仪器有限公司；pH 计（Mettler Toledo Delta 320），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热恒温培养箱（GNP-9160），上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HWS24），上海一恒科技有限公司。

1.2.2 试剂 果胶酶（A，B，C，D 4 种，酶活均为50 000 U/g），纤维素酶（100 000 U/g）；其它化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水（18MΩ）Millipore Milli QRG 超纯水系统制备。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓热处理灭酶方法 每组取40 个鲜果，在不同温度热水（料液比1∶20）中进行烫漂灭酶处理，处理参数为100 ℃（0.5，1.0，1.5，2.0 min），90℃（0.5，1.0，1.5，2.0 min），80 ℃（1.0，1.5，2.0，3.0 min），蓝莓热处理后迅速降温至10 ℃以下，-80℃冻藏备用。

1.3.2 蓝莓果浆酶解方法 果胶酶酶解方法：蓝莓果实自然解冻后，经高速捣碎机匀浆处理，冷藏备用。称取250 g 蓝莓果浆，按质量分数0.3%的比例加入不同种果胶酶，（48±1）℃酶解60 min，酶解后的果浆经5 000 r/min 离心20 min 后获得蓝莓原果汁。以常温不酶解为对照。

复合酶酶解方法：控制酶制剂总添加量为0.3%，优选的果胶酶与纤维素酶添加比例分别为（4∶1，3∶1，2∶1，1∶1），以常温不酶解和果胶酶为对照。

1.3.3 破损率 以果实表皮破损，果肉软烂为破损果。计算公式：

1.3.4 出汁率 酶解后获得的果汁质量占原果浆比例。计算公式：

1.3.5 PPO 和POD 活性的测定[15]取蓝莓果浆2.0 g，加入10 mL 已预冷的0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）进行匀浆，于4 ℃下15 000 g 离心20 min，收集上清液用于酶活性测定。

POD 活性的测定：3 mL 反应液包括：质量分数4.0%的愈创木酚0.1 mL，质量分数0.46%的H2O20.1 mL，0.2 mol/L 的pH 7.0 磷酸缓冲液2.75 mL 和酶液0.05 mL。加入酶液测定OD470变化，以每分钟OD470升高0.01 表示一个酶活性单位。以缓冲液调零，依次加缓冲液，愈创木酚，酶液，最后加H2O2快速混匀，连续读取3 min。

式中，Vt——提取酶液总体积，mL；W——样品质量，g；Vs——测定酶液体积，mL；t——反应时间，min。

PPO 活性的测定：3 mL 反应液中含有：0.05 mol/L 的pH 7.0 磷酸缓冲液1.5 mL 和0.05 mol/L邻苯二酚溶液1.0 mL，最后加入酶提取液0.5 mL，以缓冲液为参比，连续测定3 min，以每分钟内OD410升高0.01 为一个单位。

式中，Vt——提取酶液总体积，mL；W——样品质量，g；Vs——测定酶液体积，mL；t——反应时间，min。

1.3.6 花色苷测定方法[16]蓝莓鲜果称取果浆2.0 g 于50 mL 离心管中，加入20 mL 体积分数60%的乙醇溶液浸提后离心，收集上清液后，再次加入20 mL 体积分数60%的乙醇溶液浸提离心，合并两次上清液，吸取1 mL 清液于9 mL 的缓冲液测定花色苷含量；蓝莓汁直接吸取1 mL 清液于9 mL 的缓冲液测定花色苷含量。

以上各指标测定均重复3 次，结果以平均值±标准差表示。

1.3.7 挥发性香气成分的测定 以蓝莓复合酶（4∶1）酶解汁和对照（未酶解汁）为样本，样本制备方法：取10 mL 蓝莓汁样品置于20 mL 的顶空瓶中，加入1.5 g NaCl。

GC-MS 条件：色谱柱HP-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃；初始温度40℃（3 min）；3 ℃/min 程序升温至160 ℃（2 min），再以8 ℃/min 程序升温至220 ℃（10 min）；载气He，流速1.67 mL/min，无分流进样，进样量1 μL。

MS 条件：离子源温度230 ℃；四级杆温度150℃；EI 电离源：电子能量70 eV；扫描范围33～550 u。

定性定量法：由GC-MS 检测蓝莓汁的香气离子流色谱峰所对应的质谱图，经NIST 谱库检索，保留匹配度大于80%的蓝莓汁的香气成分，Chemical Book 网站对比及分析，采用面积归一法计算蓝莓汁香气成分的相对含量。

1.3.8 数据处理 所有图表绘制采用Origin 8 和Excel 2003 进行处理；利用SPSS 16.0 进行显著性分析，置信概率为0.95，P＜0.05 为显著差异。

2 结果与分析

2.1 热水烫漂对蓝莓品质的影响

热水烫漂的主要目的是使蓝莓内源性酶失活，防止发生酶促褐变。水果的酶促褐变反应主要是由酶、O2及酚类物质为底物的一系列反应系统，PPO 和POD 是导致蓝莓汁褐变的关键因素[14，17]。蓝莓汁加工过程中，被氧化的酚类物质及发生降解的花色苷附着结合，产生黑褐色絮状沉淀，严重影响外观和品质。确定蓝莓最佳的热烫工艺，既有效控制PPO 和POD 活性，又减少蓝莓的功效成分损失，对保护蓝莓汁的天然色泽和营养价值尤为重要。

2.1.1 热水烫漂对蓝莓感官品质的影响 从表1可以看出，处理温度越高，处理时间越长，蓝莓果皮完整度下降，组织变软，破损率增高。100 ℃处理1 min 能较好地保证蓝莓的果皮完整和果肉的组织完好，破损率5%；90 ℃下处理时间1.5 min 内能较好地保持果皮完整和组织状态，破损率10%；80 ℃下处理3 min 果皮较完整，组织偏软，无破损。因此，从控制蓝莓营养成分流失方面考虑，较适宜的热水处理温度及时间100 ℃处理1 min，90℃处理1.5 min，80 ℃处理3 min 均能控制蓝莓破损率在10%以内。

表1 热水烫漂对蓝莓感官品质的影响Table 1 Effect of blanching on sensory quality of blueberries

2.1.2 热水烫漂对蓝莓PPO 和POD 的影响 PPO是呼吸链末端氧化酶之一，蓝莓的PPO 在果汁加工过程中能催化多酚类物质氧化、聚合形成黑褐色物质而导致酶促褐变，不仅使果汁色泽变暗，且降低了蓝莓汁的生物学功效，严重影响蓝莓汁的商品价值[18]。POD 与果蔬产品及其制品的变色和变味关系密切[19]。同时，POD 酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度[20]。

由图1可知，热水热烫可使蓝莓PPO、POD 活性显著降低，且不同处理间差异显著（P＜0.05）。热水热烫对PPO、POD 活性的抑制作用受温度影响较大，当热烫时间1 min 时，80 ℃时POD 残余酶活力降至30%以下，100 ℃时POD 残余酶活力降至4.9%，接近失活。此结果与刘小莉等[21]的研究结果一致。这可能是由于蓝莓中PPO 酶热稳定性较低，在热水热烫作用下迅速失去活性。当热烫温度80 ℃处理1 min，POD 残余酶活力均在30%以上，但当温度达90 ℃时POD 残余酶活力低于20%，100 ℃时POD 残余酶活力低于15%，且随热烫时间延长，其相对残余活性大大降低。果蔬热烫过程中，热烫时间延长有助于酶的钝化作用，且不同果蔬品种酶的稳定性也有较大差别。常用的酶热抑活方法是水烫漂，且比蒸汽烫漂更有效。影响酶热失活的因素主要是温度和受热时间，热处理足够长的时间会使PPO 和POD 失活更完全，但长时间加热对保持果蔬的营养和风味不利。Vamos[22]报道POD 酶有较高的热稳定性，因此常以POD 酶是否失活作为热烫是否充分的标准。李星贺等[23]采用超高压钝化蓝莓汁中PPO 和POD 两种褐变酶，POD 失活所需温度较PPO 高。由以上分析可知，蓝莓POD 灭活需要较长时间，因此POD 较PPO热稳定性高。

图1 热烫处理对蓝莓PPO 和POD 酶活的影响Fig.1 Effect of blanching on PPO and POD activities of blueberry

2.1.3 热水烫漂对蓝莓花色苷影响 花色苷对果汁品质、身体健康都有重要作用，Kim 等[24]研究发现蓝莓功能饮料的功能信息对消费者的健康要求感知产生了积极的影响，如消费者对“缓解眼部疲劳”的认知，因此蓝莓汁加工中花色苷的保留具有重要价值。但果蔬中的花青素极不稳定，其降解主要与吡咯环的开放和查尔酮的形成有关。查耳酮的形成是花青素降解的第一步，之后继续降解，形成化合物如间苯三酚醛和原儿茶酸，降解影响其生物活性[25]。花青素受加工条件包括pH、温度、光、氧以及酶和金属离子的影响。

从图2可以看出，热烫温度越高，花色苷含量损失越大，同一温度下，随着热烫时间延长，花色苷含量呈下降趋势。因此，综合热处理对蓝莓感官品质、褐变酶控制及花色苷保留的研究结果，选择较适宜的热处理工艺为80 ℃下保持2.0 min，果皮较完整、无破损，营养成分及功效成分流失少，褐变相关酶活基本被抑制。

2.2 蓝莓NFC 果汁的酶解预处理研究

图2 热水烫漂对蓝莓花色苷的影响Fig.2 Effect of blanching on anthocyanin of blueberry

2.2.1 蓝莓果汁加工的适宜果胶酶筛选 果胶酶可以催化果胶中的甲酯水解，将多半乳糖醛酸分解成较小分子多聚物。蓝莓汁中含有果胶，果汁黏度大导致果汁的出汁率降低，果胶酶处理后能释放出更多的蓝莓汁，并促进花色苷的溶出，降低黏度，果汁与果渣更易分离，提高出汁率和生产能力[8]。Yamasaki 等[26]研究表明果蔬汁中的果胶在果胶酶的作用下发生部分水解，使果汁黏度降低。Sandri 等[27]研究了一株新黑曲霉所产果胶酶应用于蓝莓汁的酶处理。

从图3可以看出，蓝莓果浆经不同的果胶酶处理后，蓝莓汁的出汁率、可溶性固形物和花色苷含量明显上升，在蓝莓果浆的酶解工艺中宜采用B 酶制剂，其处理后的蓝莓出汁率、固形物含量及花色苷含量最高，增加蓝莓汁的营养性及功能性。

2.2.2 复合酶制剂对蓝莓果汁的影响 纤维素酶可将纤维素中的β-1，4 糖苷键水解，生成可溶性的聚合物、寡糖、β 糊精、二糖和D-葡萄糖等[27]。果胶酶和纤维素酶复合酶解，不仅有助于植物细胞壁的降解，提高果蔬出汁率，同时可增加果蔬汁中可溶性固形物及功效成分的含量。

图3 不同果胶酶对蓝莓汁的影响Fig.3 Effects of different pectinases on blueberry juice

表2 不同比例复合酶对蓝莓汁的影响Table 2 Effects of different proportion of complex enzymes on blueberry juice

由表2可知，当果胶酶与纤维素酶比例为1∶1～4∶1 时，出汁率与可溶性固形物随果胶酶的增加而增大，果胶酶∶纤维素酶4∶1 时的出汁率最高为（81.8±1.5）%，可溶性固形物最高为（11.6±0.1）°Brix。相比对照，果胶酶∶纤维素酶4∶1 处理的蓝莓出汁率提高了15.9%。在酶制剂总量一定的条件下，果胶酶B 单独处理的出汁率（76.2±1.7）%，复合酶4∶1 处理提高蓝莓出汁率5.6%。此结果与菅蓁等[10]的研究相比，酶用量0.3%一致的条件下，出汁率提高19.75%。蓝莓果实中的花色苷主要分布在果皮中，结合在果皮细胞壁中，经过复合酶处理后，花色苷溶出果汁，其含量显著上升，提高了约1.9 倍，程红等[18]报道复合酶解后花色苷含量增加1.5 倍。因此复合酶处理选择果胶酶与纤维素酶比例4∶1 为宜。

2.2.3 蓝莓汁酶解前后果汁的香气成分变化 果胶酶和纤维素酶同时作用，不仅可以降解植物细胞壁提高出汁率和营养价值，而且能释放出内源酶，使之与风味前体物反应，提升风味及香气强度[10，27]。蓝莓汁酶解前后香气成分的检测结果见图4，表3。图4是蓝莓酶解汁及未酶解汁的香气成分总离子流色谱图，从图可以看出酶解前后的蓝莓汁香气成分有较大相似性。

表3是蓝莓酶解汁及未酶解汁的GC-MS 分析结果。从表3可以看出，蓝莓未酶解汁与酶解汁共检出酯类、烯烷类、醇类、酮类、醛类和羧酸类、杂环类共59 种挥发性物质，其中酯类11 种、烯烷类8 种、醇类16 种、酮类8 种、醛类7 种、羧酸类3 种、杂环类6 种。蓝莓未酶解汁香气成分为45种，占峰面积的88.41%，酶解汁香气成分为42种，占峰面积的90.59%。蓝莓未酶解汁、酶解汁相对峰面积超过10%的组分有乙酸乙酯 （分别为25.17%，30.36%）和异戊酸乙酯（分别为13.35%，15.2%）。

图4 未酶解蓝莓汁（上）与酶解汁（下）的GC-MS 总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in un-enzymatic juice （top）and enzymatic juice （bottom）

表3 蓝莓未酶解汁和酶解汁的香气成分GC-MS 分析Table 3 GC-MS analysis results of the volatile components in un-enzymatic and enzymatic juice of blueberry

（续表3）

图5 蓝莓未酶解汁和酶解汁的各类风味物质相对含量Fig.5 Relative contents of flavor components in un-enzymatic and enzymatic juice of blueberry

从图5可以看出：蓝莓汁酶解后酯类含量明显上升，增加了20%，主要是乙酸乙酯、异戊酸乙酯和邻苯二甲酸二丁酯含量增高，同时增加了乙酸异戊酯和苯甲酸乙酯新成分。这与Essa 等[28]研究结果基本一致，其采用果胶酶和纤维素酶酶解刺梨汁，发现风味品质明显提高，乙酸乙酯和内酯等特征香气成分的含量增加。烯烷类、酮类、醛类和羧酸类、杂环类均有不同程度增加；醇类含量降低了33.41%，氧化芳樟醇、芳樟醇、香叶醇、苯乙醇、2-乙基-1-己醇等含量增加明显。文献报道芳樟醇与香叶醇等物质对于构成蓝莓特有香气起重要作用[29]。

水果的风味不同主要由酯类、烯烷类、醇类和醛类等挥发性物质组成决定。总体来说，未酶解汁与酶解汁的挥发性成分相对含量变化较小，整体上保留了蓝莓果汁香气的稳定性和协调性，同时有部分潜在的香气成分释放，酶解后的蓝莓汁香气成分增加2.18%，增加了果汁中的芳香物质含量，强化了蓝莓汁的香气，起到增香的效果。本研究的酶解增香效果与关小莺等[30]研究的南高丛蓝莓浊汁酶解前后挥发性成分变化存在差异，可能与蓝莓原料、酶用量及酶解汁灭酶条件等不同有关。

3 结论

酶促褐变控制及酶解高效制汁等预处理对蓝莓NFC 果汁加工至关重要，本研究开展热水烫漂参数对蓝莓品质的影响，结果表明80 ℃热烫2 min 对控制蓝莓褐变酶活性和保留花色苷功效成分具有较好的效果。优选的果胶酶和纤维素酶按4∶1 的比例应用于蓝莓的酶解处理，出汁率高达（81.8±1.5）%，可溶性固形物相比未酶解提高1.4°Brix，花色苷含量是未酶解的1.92 倍，酶解后的果汁香气成分也略有增加，起到增香的效果。

NFC 果汁非常适于现代都市生活的流行趋势，并且可以迅速成为人们的新宠。蓝莓果汁加工采用热水烫漂钝化褐变酶活性是简单有效的方法，但热处理对蓝莓营养价值造成一定损失。果汁加工中酶促褐变主要发生在破碎、压榨工序[31]，因此采用有效的冷加工处理方法是未来的研究方向，如低温打浆或充氮打浆等措施控制果汁的酶褐变，避免营养品质的损失。随着生物技术的迅猛发展，生物酶解技术将会越来越多地应用于蓝莓NFC 果汁加工，在提高蓝莓出汁率的同时达到增香和增味作用，使蓝莓汁的营养、风味与功效性成分完全释放，提升蓝莓果汁品质。