酶解制备竹笋可溶性膳食纤维及其抗氧化活性研究

万仁口，贺杨正，李功景，张 兵，李红艳，邓泽元

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

竹笋一般是指竹鞭或秆基上萌发分化而成的膨大的芽和幼嫩的茎[1-2]，其种类繁多，分布广泛，主要盛产于热带、亚热带和温带地区。其肉质鲜嫩，甜脆爽口，具有很长的食用历史，是一种深受人们喜爱的纯天然绿色健康食品[3-4]。竹笋含有蛋白质、多糖、氨基酸、维生素、矿物质等营养物质，具有一定的营养作用[5-7]。特别是竹笋含有丰富的膳食纤维，在肠内可减少人体对脂肪的吸收，有润肠、加强胃肠蠕动、去积食、防便秘[8]等特性，因此具有预防结肠癌等肠道疾病的作用；长期摄食膳食纤维可以降低心血管疾病、糖尿病、肥胖和胃肠道疾病的风险[7，9]。竹笋含有甾醇如β-谷甾醇，是一种强生理活性物质，具有降血脂、抗肿瘤、防治心脏病和抑制白血病细胞生长等生理功能[1，10]。竹笋还含有黄酮类物质，它是植物的次级代谢产物，具有保护人体血管的功能[11]。竹笋是碱性食物，能中和人体代谢过程中留在体液中的酸性物质，提高人体的抗病能力。中医认为竹笋性甘、微寒，能清热去痰，对咳嗽、高血压、便秘、糖尿病等均具有一定疗效，被誉为“素食第一品”，具有一定药用价值和保健功效。

膳食纤维可以作为功能食品的原材料[12]，根据水溶性的不同，分为可溶性膳食纤维（SDF）和不溶性膳食纤维（IDF）两种[13-14]。竹笋膳食纤维中SDF 的比例是影响其生理功能的主要因素，高品质的膳食纤维SDF 含量高，而通常天然纤维中SDF 的含量仅为3%～5%，严重限制了其在食品工业的运用[15]。为了获得高品质的高生物活性的膳食纤维，需对原料进行改性处理[16-17]。膳食纤维的改性技术主要有化学改性、生物改性及物理改性3 种[18-19]。酶解法是生物改性技术的一种，因其反应温和、污染物较少而使用较为广泛[20-21]。

本研究采用酶解法来制备竹笋可溶性膳食纤维，以纤维素酶为水解酶，通过单因素和正交试验优化酶解pH 值、酶解温度、酶添加量和酶解时间等工艺条件，同时考察竹笋膳食纤维乙醇提取液对DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率及铁还原能力的影响，为高附加值开发竹笋提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹笋，江西广雅食品有限公司；纤维素酶，南宁庞博生物工程有限公司；胰酶、糖化酶、α-淀粉酶、DPPH，阿拉丁试剂有限公司；MES、TRIS，索莱宝生物科技有限公司；无水乙醇、无水甲醇，上海西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

K9860 自动凯氏定氮仪，海能仪器器械有限公司；SX2 型马弗炉，上海新苗医疗器械制造有限公司；SXT-06 索氏提取器，上海洪记仪器设备有限公司；SHZ-A 水浴恒温振荡器，上海博讯实验有限公司医疗设备厂；酶标仪，美国博腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 竹笋的成分测定 水分含量按GB5009-2010 中的直接干燥法测定，蛋白质含量按GB5009.5-2016 中的自动凯氏定氮法测定，灰分含量按GB5009.4-2016 测定，粗脂肪含量按GB5009.6-2016 中的索氏提取法测定，膳食纤维含量按GB5009.88-2014 测定，总糖以及甾醇含量的测定分别采用苯酚硫酸法和有机溶剂提取法。

1.3.2 酶改性法制备竹笋可溶性膳食纤维

1.3.2.1 单因素试验 准确称取5 g 竹笋样品于500 mL 高脚烧杯中，加入0.05 mol/L MES-TRIS缓冲液200 mL，依次加入250 μL α-淀粉酶、500 μL 糖化酶以及0.225 g 胰酶于60 ℃恒温振荡水浴环境中分别反应30 min，以去除淀粉、脂质以及蛋白质[22-23]。而后添加纤维素酶于一定条件下（pH、酶解温度、酶添加量、酶解时间）继续酶解，测定竹笋SDF。

1.3.2.2 正交试验 根据单因素优化试验结果，选择上述4 个因素，以L9（34）正交表进行正交试验，以进一步优化酶解条件。

1.3.3 膳食纤维的抗氧化性

1.3.3.1 样品处理 称取一定质量的SDF、IDF 以及TDF 于50 mL 离心管中，并用50%乙醇定容至刻度以配成质量浓度为0.625～20 mg/mL 的混合液。将其置于60 ℃恒温水域摇床振荡4 h，而后于4 000 r/min 的转速下离心15 min，上清液即为乙醇提取液，分别记做SDFE，TDFE，IDFE。

1.3.3.2 DPPH 自由基的清除能力[24]分别在10 mL 的具塞试管中加入2 mL 质量浓度为0.065 mg/mL 的DPPH 溶液，再加2 mL 的SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox（BHT）溶液，充分振摇混匀，在暗处静置30 min 后移取100 μL 反应液至96 孔板，在517 nm 下测定吸光度值。以2 mL 样品溶液加入2 mL 无水乙醇作为对照，以2 mL DPPH 溶液加入2 mL 溶剂作为空白，计算对DPPH 自由基的清除率。其对DPPH 自由基的清除能力按以下公式计算：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai——DPPH 溶液+样品溶液的吸光度值；Aj——样品溶液+无水乙醇的吸光度值；Ao——DPPH 溶液+无水乙醇的吸光度值。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力[25]取5.0 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L的K2S2O8，在室温下置于暗处反应12～16 h，形成ABTS+自由基储备液，而后用体积分数80%的甲醇稀释ABTS+自由基储备液备用。准确量取0.1 mL的SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox（BHT）溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混匀，在室温下反应6 min，于734 nm 处测定吸光度AE。同时吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL 体积分数80%的甲醇溶液于734 nm 处测定吸光度AB。其对ABTS+自由基清除率按以下公式计算：

清除率（%）=[1-（AE-AK）/AB]×100

式中：AE——ABTS+溶液+样品溶液的吸光度值；AK——样品溶液+80%甲醇溶液的吸光度值；AB——ABTS+溶液+80%甲醇溶液的吸光度值。

1.3.3.4 铁还原能力（FRAP）测定[26]分别在10 mL 的具塞试管中移取SDFE，TDFE，IDFE溶液或Trolox （BHT）溶液100 μL，加入预热至37 ℃的FRAP 工作液1.8 mL，摇匀置37 ℃恒温水域反应30 min，反应后分别移取100 μL 反应液置96 孔板中，用酶标仪在593 nm 处测定其吸光度值，同时进行空白试验。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 竹笋中的主要成分

竹笋中主要成分含量如表1所示。竹笋中的水分以及总糖含量是影响其老嫩程度、滋味口感的两个重要影响因素，总糖及水分含量越高，竹笋的口感越好，品质越佳[27-28]。由表可知，竹笋的水分含量为95.20%，高于小佛肚竹笋（90.90%）[29]、云南箭竹（93.43%）[28]等大多数竹笋；总糖含量为14.32%，含量较小佛肚竹笋（16.04%）低，略高于云南箭竹（11.80%），但远高于文献所报道的常见蔬菜（2.00%～5.40%）的含量。由此可见该竹笋的品质较高，鲜嫩、口感较好。蛋白质和粗脂肪含量分别为28.20%和4.31%，蛋白质的含量高而粗脂肪含量低，表明竹笋是一种含有丰富蛋白质，天然低脂、低热量的健康食物。竹笋中还含有甾醇（29.00 mg/100 g）。膳食纤维是竹笋的主要组成成分，总膳食纤维占干竹笋质量的70.06%，其中IDF为64.53%，SDF 为5.53%，IDF/SDF 为11.722，可溶性膳食纤维的含量较低。综上所述，竹笋是一种含有丰富蛋白质、膳食纤维以及其它生物活性物质且鲜嫩度高、口感好的食材。

表1 竹笋主要成分Table 1 The composition of bamboo shoots

2.2 酶改性工艺的选择

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 pH 值对SDF 含量的影响 以竹笋粉末为原料，纤维素酶作为水解酶，酶解温度为60℃，酶解时间为1 h，酶添加量为0.1%，pH 分别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 时，测定不同pH 值下酶解竹笋粉末SDF 的含量，以确定纤维素酶最佳的酶解pH 值。

不同pH 值酶解获得可溶性膳食纤维的含量如图1所示，当pH 3.5 时含量最低，而后随着pH的不断上升，SDF 含量有显著的增加。pH 4.5 时达到最高，约为7.5%，之后随着溶液酸性减弱，SDF 的含量也相应降低。pH 通过影响纤维素酶的活性影响可溶性膳食纤维的含量，当pH 在4.5 左右时，纤维素酶活性最佳，酶解效果最好，所以选择提取液pH 4.5 做进一步试验。

2.2.1.2 酶解温度对SDF 含量的影响 酶解温度分别设定为30，40，50，60，70 ℃，酶解时间1 h，酶添加量为0.1%，pH 为4.5，通过测定SDF 含量来研究不同酶解温度对纤维素酶酶解竹笋反应的影响。

图1 不同酶解pH 值对竹笋SDF 含量的影响Fig.1 Effect of different pH values on SDF content

图2 不同酶解温度对竹笋SDF 含量的影响Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on SDF content

由图2可见，随着酶解温度的升高，竹笋可溶性膳食纤维的含量也增加，直到温度为50 ℃时达到最高值8.4%，而后随着温度的升高，其含量快速下降。酶的活性变化是影响SDF 含量的主要因素，当温度较低时，酶的活性较弱，酶分解不溶性膳食纤维生产可溶性膳食纤维的效果较差，而后随着温度升高，酶活力不断提升，到50 ℃左右达到纤维素酶的最适温度，再升高温度，酶逐渐失活，从而使SDF 含量下降[20]。因此，选择纤维素酶的酶解温度为50 ℃。

2.2.1.3 酶添加量对SDF 含量的影响 酶的添加量用与底物质量百分比来衡量，酶用量选取0.1%，0.2%，0.5%，1%，2%，酶解温度为50 ℃，酶解时间为1 h，pH 为4.5，通过测定SDF 含量，研究不同酶添加量对纤维素酶酶解竹笋反应的影响。

由图3可见，随着酶添加量的增加，可溶性膳食纤维的含量先逐步增加而后趋于稳定。当酶添加量为0.5%及以上时，其SDF 含量在10%附近浮动。当加酶量较低时，不溶性膳食纤维被纤维素酶降解，其中的不溶性半纤维素可酶解为可溶性半纤维素甚至变成葡聚糖，有效提高了SDF 的含量；当加酶量在高水平时，所得到的SDF 进一步水解，生成分子质量更低且不能被乙醇沉淀的糖类物质，降低了SDF 的得率[6]。选择适量的加酶量可以维持IDF 和SDF 的水解平衡，使得SDF 的含量达到最大。因此，纤维素酶的添加量选择0.5%最为合理。

2.2.1.4 酶解时间对SDF 含量的影响 酶解时间分别取1，2，3，4，5 h，酶解温度设定为50 ℃，酶添加量0.5%，pH 为4.5，通过测定SDF 含量，研究不同酶解时间对纤维素酶酶解反应的影响。

不同酶解时间对可溶性膳食纤维含量的影响如图4所示，酶解时间为3 h 最佳，SDF 的含量最高可达10.8%。酶解时间短，则酶解不完全；酶解时间过长，SDF 会进一步降解而导致含量降低。因此，选择酶解时间为3 h。

2.2.2 正交试验 根据单因子试验结果，正交试验的设计为pH 值、酶解温度、酶添加量、酶解时间等4 个因素，每个因素3 个水平，见表2。

正交试验结果见表3，根据极差R 值可以看出，影响SDF 含量大小的因素排序为：D>C>B>A。酶解时间的影响最大，酶解pH 值的影响最小。根据各因素k 值和直观比较，最佳工艺条件为A3B1C3D3，即SDF 最佳的酶解工艺为：pH 值为5.0，酶解温度45 ℃，酶添加量0.7%，酶解时间3.5 h。

图3 不同酶添加量对SDF 含量的影响Fig.3 Effect of different enzyme additions on SDF content

图4 不同酶解时间对SDF 含量的影响Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on SDF content

表2 正交试验因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factor-level table

2.3 竹笋膳食纤维的抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH·是一种能够在室温条件下保持稳定的有机自由基，当抗氧化剂或供氢体出现时，稳定的自由基变成DPPH-H[30]。不同纤维浓度提取液SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 的DPPH 自由基清除率如图5所示，在纤维质量浓度为0.625 mg/mL 时，BHT 和Trolox 抗氧化剂的DPPH·清除率为80%～90%，而SDFE、TDFE、IDFE三者DPPH 自由基的清除率分别为21%，7.0%和6.7%。随着纤维浓度的升高，两种抗氧化剂的清除率迅速趋于100%，表现出极强的抗氧化性。SDFE、TDFE、IDFE的清除能力随着浓度的升高呈明显上升趋势，在质量浓度为20 mg/mL 时，SDFE的DPPH·清除率可达75.77%，明显高于TDFE（16.9%）以及IDFE（14%），表明高纤维浓度SDFE对DPPH·有较强的清除能力，3 种膳食纤维乙醇提物在相同纤维浓度下的DPPH·清除能力大小顺序为SDFE>TDFE>IDFE。

表3 正交试验设计及其结果Table 3 Orthogonal experimental design and its results

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基被广泛应用于样品的总抗氧化能力的测定，当样品中存在抗氧化成分时，反应体系颜色变浅，在734 nm 处吸光度降低，吸光度越低，表明所检测物质的总抗氧化能力越强[31]。图6结果显示，随竹笋纤维浓度的增加，SDFE、TDFE、IDFE清除ABTS+自由基能力逐渐增强，且呈一定正相关性，但其清除率明显低于BHT 和Trolox。在纤维质量浓度为20 mg/mL 时，SDFE、TDFE、IDFE的ABTS+清除率分别可达70.2%，30.0%和13.1%，在同等纤维浓度下，SDF 提取物的清除能力明显优于TDF 和IDF 的醇提取物，即ABTS+清除率能力大小规律为SDFE> TDFE> IDFE。

图5 不同纤维浓度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的DPPH 自由基清除率比较Fig.5 Comparison of DPPH· scavenging rate of ethanol extracts （SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

图6 不同纤维浓度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的ABTS+自由基清除率比较Fig.6 Comparison of ABTS+ scavenging rate of ethanol extracts （SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

2.3.3 铁还原能力测定 还原能力是衡量抗氧化物质能否高效提供电子的重要评价指标，还原能力强的样品是良好的电子供体，可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质，以中断自由基的连锁反应。研究表明，抗氧化活性同还原力之间呈正相关关系，物质的吸光度越大，还原能力越强，其抗氧化能力也越高。由图7可知，SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 抗氧化剂等5 种物质的吸光度值均与其质量浓度呈正相关，随着浓度的升高还原能力也随之增强。在相同浓度时，BHT 和Trolox 的总还原能力明显优于SDFE、TDFE、IDFE的还原能力，SDFE的铁还原能力明显优于TDFE与IDFE，还原能力大小规律与DPPH·清除能力以及ABTS+清除能力一致。

2.3.4 抗氧化指标的线性分析 竹笋SDFE，TDFE以及IDFE对DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力，并随质量的增加而增强，呈较强的线性关系，R2均在0.876～0.968 之间，但不同膳食纤维抗氧化指标的IC50差别较大。

在还原力试验中，吸光度值越高，表示还原能力越强。由表4可知，竹笋3 种膳食纤维提取物均具有一定的还原能力，并呈现出与其它两种抗氧化指标相似的规律，随着样品质量浓度的增加而增强，且有很大的相关性，R2分别为0.9875，0.9278 和0.9189。

图7 不同纤维浓度乙醇提取液（SDFE、TDFE、IDFE）的铁还原能力比较Fig.7 Comparison of FRAP assay of ethanol extracts（SDFE，TDFE，IDFE）at different concentrations of dietary fiber

表4 SDFE、TDFE、IDFE 抗氧化指标的线性分析Table 4 Linear analysis of antioxidant indices of SDFE，TDFE，IDFE

3 结论

竹笋中的蛋白质含量高达28.2%，且其氨基酸种类丰富；膳食纤维的量为70%，但可溶性膳食纤维的含量仅为5.53%。采用纤维素酶解法对竹笋进行改性处理，对酶解的pH 值、酶解温度、酶的添加量以及酶解时间进行单因素试验和正交试验，得出最佳的pH 值为5.0；酶解的最适温度为45 ℃；酶的适宜添加量为0.7%；最佳酶解时间为3.5 h。竹笋膳食纤维乙醇提取液SDFE、TDFE以及IDFE均具有一定程度的抗氧化活性，且DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率以及铁还原能力与纤维浓度均有较强的正相关性。