lg1核苷酸多态性与玉米叶夹角的关联分析

褚梦寒 陈亚男

(扬州大学，江苏 扬州225000)

0引言

近年来，玉米种植面积逐步减少，社会发展所需的玉米急剧增加，通过培育玉米耐密新品种增加种植密度提高单位面积产量增加总产从而满足社会需求。玉米叶夹角等叶片性状决定了叶片的空间分布状态，对玉米的耐密性具有重要影响。已有文章证实[1-2]，玉米叶片面积以及叶夹角决定了玉米作物所获得的光和有效辐射，进而可以影响以玉米树冠层的光合作用[3]。叶夹角角度减小，增大叶片中脉与地表面的夹角，可以有效改善玉米群体植株中下部的光照条件，提高玉米植株群体密度，在单位面积内可以种植更多的群体，最终达到增加产量的效果[4]。本研究中我们发现了玉米lg1基因可能参与玉米叶夹角形态的建成，通过对348份自交系、68份地方品种和32份大刍草的lg1基因重测序，分析lg1基因的核苷酸多态性；对自交系叶夹角表型与lg1基因进行关联分析，检测与叶夹角性状相关的优异变异位点和单倍型，探究lg1基因在玉米驯化和改良过程中的作用。

1材料和方法

1.1供试材料与试验设计

供试材料包含348份玉米自交系、68份玉米地方品种以及32份大刍草。种植田间试验采用完全随机区组设计，双行种植，设置2个区组重复，标准化田间管理，本研究对上述3个环境下的348份玉米自交系的表型数据进行了大田鉴定用于开展候选基因关联分析。

1.2DNA提取和lg1重测序

本实验利用玉米幼叶使用CTAB法从叶片中提取基因组DNA。华大基因生命科技有限公司在NimbleGen平台上使用靶向序列捕获技术对lg1基因进行测序[5]，为了涵盖基因的5′-非翻译区(UTR)和3′-UTR区段，同时对基因启动子前约1500bp和终止密码子后约500bp进行测序。以来自B73(RefGen_v3)中的lg1(GRMZM2G36297)基因组序列作为参考，使用MAFFT软件对捕获靶序列进行比对[6]。

1.3基因型数据分析、遗传多样性分析和中性进化检验

使用BioEdit软件对获得的序列进行手动编辑。基因5′-UTR、3′-UTR、编码区和内含子参照该基因B73(RefGen_v3)进行注释。采用DNASP6.0软件进行序列多态性、遗传多样性分析和中性进化检验[7-8]。并以此来衡量多态性位点间的LD水平。使用TASSEL5.0软件计算基因序列上多态性位点的连锁不平衡参数r2，并以此来衡量多态性位点间的LD水平。

1.4lg1与玉米自交系中叶夹角性状的关联分析

利用TASSEL5.0软件结合群体结构和亲缘关系，共选取了530个等位基因频率(MAF)>0.05的标记，采用混合线性模型(MLM)进行供试自交系根系表型和基因型的关联分析，显著p值阈值设为0.0018(1/530，-log10(p)>2.74)。

2结果与分析

2.1lg1基因序列变异

lg1基因在不同群体间的核苷酸多态性。

以玉米参考基因组B73(RefGen_v3)的lg1基因序列为参考模板，在348份玉米材料中定点捕获到该基因序列全长。利用ClustalX软件对lg1基因序列进行多重比对以及人工校对。基因序列比对完成后，利用DnaSP 6.0软件对lg1基因的序列变异进行分析，如表1所示。该基因序列包含了9个区段，共测序了lg1基因6305 bp的基因组区域，在地方品种和大刍草中，lg1的序列表现出相似的保守性(CL=0.936，CT=0.910)。在自交系中该基因的保守性比其他两个群体较高(CI=0.740)。就核苷酸多态性而言，大刍草的核苷酸多态性最高，地方品种的多态性略低于自交系(π*1000T=10.47，π*1000L=17.19，π*1000I=32.85)。本研究分别计算了3个群体内lg1基因的Tajima’sD值、Fu and Li’sD*和Fu and Li’sF*值，在大刍草中Fu and Li’sD*达到了显著水平，而Tajima’s D和Fu and Li’sF*均未达到显著水平(表1)，说明lg1在大刍草中可能在一定程度上偏离了中性进化，但在地方品种和自交系群体内符合中性进化。

表1 自交系、地方品种和大刍草的核苷酸多态性分析

2.2lg1与叶夹角性状的单倍型分析

7个显著标记均位于基因启动子区段区段，其中包含4个SNP位点，3个Indel位点。贡献率在4.67% ～ 6.78%之间(表2)。基于7个变异位点(SNP/Indel)与LA(叶夹角)显著关联(图2a)，连锁不平衡分析结果表明，SNP-881与SNP-884位点之间处于完全强连锁位点，SNP-1175与SNP-1176位点之间也是完全强连锁位点，InDel-1133、InDel-1136、InDel-1137三个位点也处于较强的连锁不平衡(2b)。基于这7个显著位点可以将自交系划分为3种主要单倍型(图2c)，方差分析结果显示Hap1与Hap2间的LA达到了极显著差异(P=7.69e-03)，Hap2与Hap3间的LA达到了极显著差异，而Hap1与 Hap3两两之间不存在显著差异。分析了SNP-1176在自交系、地方品种和大刍草中的等位基因频率发现，在大刍草和地方品种中等位基因频率小于自交系中等位基因频率(图2d)，表明了SNP-1176在驯化过程中可能受到了选择。

表2 lg1与叶夹角性状关联的显著标记

3结论与讨论

玉米基因组中存在大量的变异，常见的变异类型包括SNP和Indel[9]。本研究发现lg1的非编码区核苷酸多态性较高，存在丰富的自然变异位点，关联分析结果显示显著位点均位于基因上游区段。众多研究表明，植物基因上游区段的变异可能会影响基因的表达或引起部分表型的变化，如张君等文章表明该ZmCLA4基因在2个亲本间的基因片段中有插入和缺失，通过关联分析，证明该基因与叶夹角显著关联，通过验证该基因的表达能力，发现该基因的表达量与叶夹角大小呈现负相关性，从而使叶夹角增大。

图2lg1的自然变异与LA显著关联。(a)基于lg1与LA的关联作图；(b)与LA显著关联的7个变异位点的LD热图；(c)不同单倍型间的LA的比较；(d)SNP-1176在不同群体中的等位基因频率

玉米叶夹角是理想株型的重要形态指标之一，是在选育玉米品种以及实现高产中关注的重要性状。本研究在lg1上游同样发现了与玉米叶夹角性状的自然变异，其变异位点的分布、叶夹角性状的基因层面联系等信息，是叶夹角形状相关基因的变异及其功能表达等研究的重要线索。