桑里白粉病菌重寄生真菌的分离与鉴定

2021-04-21 08:35韩宁宁王正贤黄奕蔓廖咏梅
中国生物防治学报 2021年2期
关键词:分生孢子白粉病桑园

韩宁宁,王正贤,黄奕蔓,廖咏梅

(广西大学农学院,南宁 530005)

关 键 字:桑里白粉病菌;重寄生真菌;尖孢枝孢;刀孢蜡蚧菌

桑白粉病是桑树上的一种重要病害,根据其发生部位不同可分为桑里白粉病(桑生球针壳Phyllactinia moricola)和桑表白粉病(桑白粉菌Erysiphemori)[1]。桑白粉病的发生导致桑叶产量降低、质量变劣,喂食感染白粉病桑叶的家蚕体质弱,易诱发蚕病,蚕茧量、茧层量、茧层率均降低,严重影响蚕丝产业[2]。目前,对桑白粉病的防治主要以化学防治为主,但化学药剂的长期使用不仅会造成环境污染,还会使桑白粉病菌产生抗药性,导致化学药剂施用剂量增大,对非靶标生物也产生杀伤作用,致使桑白粉病的自然控制力降低甚至消失;由于桑白粉病在晚秋时形成封闭的闭囊壳越冬,化学药剂无法直接接触子囊及子囊孢子而降低了防治效果。重寄生真菌在植物病害生物防治中是非常重要的菌物资源,已经越来越受到各国植物病理学家的重视。李利等[3]综述了白粉菌的重寄生真菌在国外的应用情况,其中白粉寄生孢Ampelomyces quisqualis已被成功地用来防治多种植物白粉病,Tilletiopsisminor(担子菌门Basidiomycota,外担菌纲Exobasidiomycetes的一种真菌)和球状茎点霉Phomaglomerata被用来生物防治温室作物的白粉病。李利[4]从陕西关中西部地区采集到的10科16属被白粉菌侵染的238个植物标样中,分离到白粉菌重寄生真菌3种,包括白粉寄生孢、A.humuli(与白粉寄生孢同一属的另一种真菌)和球状茎点霉,但未指出该3种重寄生真菌的寄主种类。李利[4]在关于白粉菌生防菌的文献综合中谈及国外学者 Raghavendra Rao &Pavgi于1978年报道了尖孢枝孢Cladosporiumoxysporum是桑树上一种球针壳菌P.corylea的重寄生真菌,该菌的现用名为榛球针壳P.guttata[5],榛球针壳可以寄生包括桑科(Moraceae)在内的8科11种木本植物的白粉病菌上[6]。国内邱欣[7]报道,在云南分离出一株可以捕食桑里白粉病菌分生孢子的类酵母真菌Pseudozymaaphidis。

本文开展桑里白粉病菌重寄生真菌的分离,通过形态学和分子生物学进行种类鉴定,为进一步利用重寄生真菌防治桑里白粉病提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

于 2018年不同月份,在两个桑园中采集病桑叶作为试验材料。桑园一位于广西壮族自治区蚕业科学研究院(南宁市西乡塘区下均路 10号)的桑种质资源圃,栽培管理过程不施任何化学药剂。桑园二位于广西大学农场(南宁市西乡塘区大学路100号)的生产桑叶用桑园,该桑园按常规方法管理,每年7月和12月同时喷洒石硫合剂、甲基托布津和敌百虫以防治桑树的病虫害。在3月和5月采集的病桑叶背仅有分生孢子,1月和12月采集的病桑叶背有分生孢子和闭囊壳。将1月采集的病桑叶单张平铺在室内阴干1个月后收集于纸盒中,在室内条件下存放。

1.2 桑里白粉病菌重寄生现象的观察

用毛笔将病桑叶背面的分生孢子和闭囊壳轻轻扫下,收集于2 mL离心管中,加入75%酒精消毒1 min,10000 g/min离心30 s,弃掉上清液(酒精);加入无菌水清洗1 min,10000 g/min离心30 s,弃掉上清液(无菌水),重复3次清洗,加入1 mL无菌水悬浮沉淀。镜检发现,悬浮液中主要是闭囊壳。将无菌的滤纸置于培养皿中,用微量可调移液器吸取200 μL闭囊壳悬浮液,滴到无菌滤纸上,用封口胶封闭培养皿口,置于28 ℃恒温箱培养,每隔一周在滤纸边缘加入2 mL无菌水以保持湿度,持续6周,观察培养皿中滤纸上是否有真菌菌落生长。

1.3 桑里白粉病菌重寄生真菌的分离

用毛笔将病桑叶背面的分生孢子和闭囊壳扫下,收集于离心管中,加入1 mL无菌水制成菌液,将菌液稀释10和100倍,用微量可调移液器吸取200 μL不同稀释菌液加在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基平板上,并涂布均匀,置于28 ℃恒温箱培养24 h,观察培养皿中菌落的生长情况。

挑取1.2中滤纸上和上述PDA培养基上产生的形态、颜色及透明度等菌落特征不同的真菌单菌落,置于新的PDA培养基平板上,置于28 ℃恒温箱培养,待菌落直径达3 cm左右时,用接种针在菌落边缘挑取少许菌丝体置于新的PDA培养基上进行纯化,完成 2~3次的纯化后标注纯化菌株编号,移到2 mL离心管中的PDA培养基斜面上,培养2 d后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4 桑里白粉病菌重寄生真菌寄生性验证

于2018年12月,在桑园二(广西大学农场)采集感染桑里白粉病的桑叶(按照1.2的方法观察的结果表明,由于该桑园每年喷洒两次广谱杀菌剂及杀虫剂,未发现病桑叶上的闭囊壳有重寄生现象),按照1.2的方法收集闭囊壳于2 mL离心管中,经表面消毒后制成闭囊壳悬浮液。刮下分离到的候选重寄生真菌菌丝体(菌丝体湿重2 g)置于2 mL的离心管中,加入1 mL无菌水制成浓度为2 g/mL的菌丝体悬浮液。用移液器吸取200 μL闭囊壳悬浮液加在培养皿中的无菌滤纸上,再吸取200 μL候选重寄生真菌菌丝体悬浮液加在闭囊壳表面,用封口胶封闭培养皿并标记,置于28 ℃恒温箱培养,每隔一周在滤纸边缘加入适量无菌水以保持湿度,同时挑取部分闭囊壳进行镜检,观察闭囊壳被寄生情况,持续观察6周。以加无菌水到闭囊壳表面为对照。

1.5 桑里白粉菌重寄生真菌的种类鉴定

将分离到寄生闭囊壳的重寄生真菌菌株,于 PDA培养基平板上培养,观察重寄生真菌的菌落特征,用光学显微镜镜检其营养体和繁殖体的形态特征,初步鉴定重寄生真菌的分类地位;同时通过PCR技术扩增重寄生真菌的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS),通过测序和分析ITS区域的核苷酸序列,作为重寄生真菌种类鉴定的依据之一。用接种环刮下PDA平板上的重寄生真菌的菌丝体,用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取真菌基因组DNA,用ITS1和ITS4引物进行 PCR扩增,引物序列 ITS1为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4为5'-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3'[8]。

PCR 反应体系 20 μL:模板 DNA 1.0 μL(20 ng/μL)、上下游引物各 1.0 μL(10 μmol/L)、2×EsTaqMaster Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)10.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,进行30个循环;最后72 ℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,获得清晰的单一预期条带后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所获序列在NCBI的 GenBank数据库中与已知序列进行 Blast比对。利用 Mega 6.0软件进行系统分析,用邻接法(Neighbor-joining method,N-J法)构建ITS的系统进化树[9]。

1.6 桑里白粉病菌的高通量测序

2018年1月自桑园二采集感染桑里白粉病的病桑叶,置于室内阴干后保存4个月后,用毛笔把病桑叶背面的桑里白粉病菌轻轻扫下,用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取桑里白粉病菌的基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,观察到完整DNA并无降解现象时,送广西普斐生物信息科技有限公司,针对样品总DNA中真菌的ITS1-ITS2区域,基于Illumina HiSeq测序平台,利用双末端测序(Paired-End)的方法,构建小片段文库进行双末端测序。通过对Reads拼接过滤,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,并进行物种注释及丰度分析。

2 结果与分析

2.1 桑里白粉病菌的重寄生现象

刮取感染桑里白粉病桑叶背面的分生孢子和闭囊壳,进行光学显微镜观察发现,桑里白粉病菌上存在多种重寄生现象(图1)。有些重寄生真菌寄生在桑里白粉病菌的分生孢子上(图 1A~E),分生孢子的表面长出菌丝体(图1A,B),或分生孢子表面或内部产生大量孢子(图1C~E);有些重寄生真菌寄生在桑里白粉病菌的闭囊壳上(图1 F~H),闭囊壳上长出菌丝体(图1F),且菌丝体可长满整个闭囊壳(图1 G,H)。

图1 桑里白粉病菌的重寄生现象Fig.1 The hyperparasitism of P.moricola on mulberry

其中采自桑园一(广西壮族自治区蚕业科学研究院桑种质资源圃,管理过程不施任何化学药剂)的闭囊壳表面长有大量真菌菌丝体,而采自桑园二(广西大学农场生产桑园,管理过程每年2次喷施杀菌剂和杀虫剂)的闭囊壳表面未见长出真菌菌丝体。可见,施用化学药剂会影响桑里白粉病菌的重寄生。

2.2 桑里白粉病菌重寄生真菌的分离及其寄生性测定

自闭囊壳表面分离纯化得到9个属共23个真菌菌株(HP1-HP23),经针对闭囊壳的致病性测定结果发现,除菌株HP6-HP17可以寄生桑里白粉病菌的闭囊壳、在闭囊壳表面产生大量的菌丝体外,分离到的其他菌株均未发现重寄生现象。加无菌水的对照闭囊壳上也未发现重寄生现象。其中菌株 HP6-HP8的菌落(灰绿色)及分生孢子特征一致,菌株HP9-HP17的菌落(白色)及分生孢子特征一致。选取菌株HP8和HP9为代表菌株,进行该两类真菌的致病性测定和种类鉴定。

光学显微镜下观察,在28 ℃放置4周后,被菌株HP8寄生的闭囊壳变成空壳,闭囊壳内子囊孢子全部消失,闭囊壳失去活性(图2A,B);在28 ℃放置6周后,被菌株HP9寄生的闭囊壳,子囊及子囊孢子均被破坏,变成一团,失去原来的形态,闭囊壳也失去了活力(图2D,E)。

图2 重寄生真菌寄生桑里白粉病菌闭囊壳Fig.2 Hyperparasitic fungi parasitized on cleistothecia of P.moricola

2.3 桑里白粉病菌重寄生真菌的种类鉴定

2.3.1 桑里白粉菌重寄生真菌的形态特征 菌株HP8在PDA培养基平板上,28 ℃培养7 d,菌落灰绿色,在菌落表面有环纹,直径30 mm,菌落背面光滑,深绿色。光学显微镜下观察,菌株HP8菌丝体细长,少数微弯曲,褐色或无色,有隔膜,分生孢子梗结节状膨大;分生孢子单胞,椭圆形,褐色或无色,大小为(3~10)μm×(2~10)μm(图 3)。

图3 重寄生真菌菌株HP8的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of hyperparasitic fungus strain HP8

菌株HP9在PDA培养基上,28 ℃培养20 d后,菌落白色,在菌落表面有不明显环纹,直径70 mm,菌落背面光滑,淡黄色。光学显微镜下观察,菌株HP9菌丝体细长,无色,有隔膜;分生孢子单胞,无色,月牙形,大小为(3~5)μm×(2~3.5)μm(图4)。

图4 重寄生真菌菌株HP9的形态特征Fig.4 Morphological characteristics of hyperparasitic fungus strain HP9

2.3.2 桑里白粉病菌重寄生真菌的 ITS序列分析 用真菌通用引物ITS1/ITS4针对菌株HP8和菌株HP9的基因组DNA进行PCR扩增,获得大小约500 bp的单一条带。测序结果表明,菌株HP8的ITS序列长度为520 bp,菌株HP9的ITS序列长度为586 bp。Blast结果发现,菌株HP8的ITS序列(MT463536)与尖孢枝孢Cladosporiumoxysporum(MF135506)有100%的同源性,在系统进化树中,菌株HP8序列和尖孢枝孢(MF135506)的距离最近(图5);菌株HP9的ITS序列(MT463537)与刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae(KC881072)有99%的同源性,在系统进化树中,菌株HP9与刀孢蜡蚧菌(KC881072)的距离最近(图6)。结合形态特征及ITS序列的分析结果,鉴定菌株HP8为尖孢枝孢;鉴定菌株HP9为刀孢蜡蚧菌。

图5 菌株HP8的ITS序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of ITS sequence of strain HP8

图6 菌株HP9的ITS序列系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of ITS sequence of strain HP9

2.4 桑里白粉菌的高通量测序

室内保存了 4个月的来自桑园二的桑里白粉病病叶上的分生孢子和闭囊壳的高通量测序,获得优质reads共10.03万条,可见数据量足够大,能代表样品中的真菌种群信息。序列分析发现,桑里白粉病菌相对丰度最高,为97.02%,其次是刀孢蜡蚧菌相对丰度为 2.10%,桑表白粉病菌相对丰度为0.24%,拟鸟巢菌属的一种真菌Nidulariopsisiowensis的相对丰度为0.02%。可见,桑里白粉病菌的重寄生真菌主要是刀孢蜡蚧菌。图7是高通量测序结果中相对丰度位居前6的属。

图7 桑里白粉病菌闭囊壳样品中相对丰度前6个真菌属Fig.7 Top six fungi genera of relative abundance in sample of P.moricola

3 讨论

本文获得2种桑生球针壳的重寄生真菌,包括尖孢枝孢和刀孢蜡蚧菌。尖孢枝孢的分类地位为子囊菌门 Ascomycota、座囊菌纲 Dothideomycetes、煤炱目 Capnodiales、煤炱菌科 Cladosporiaceae、枝孢属Cladosporium;刀孢蜡蚧菌的分类地位为子囊菌门、粪壳菌纲Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales、虫草菌科Cordycipitaceae、蜡蚧菌属Lecanicillium。

尖孢枝孢除了是桑生球针壳的重寄生真菌,也是重要的植物病原菌。Baiswar等[10]报道,尖孢枝孢引起尼泊尔李Prunusnepalensis的叶枯病,苗木发病率达到40%。Willingham等[11]报道,尖孢枝孢是西番莲果实疮痂病的病原菌。黄欣阳等[12]报道,尖孢枝孢可引起设施栽培辣椒上的叶斑病。寄生桑生球针壳上的尖孢枝孢是否对其他农作物有致病性,尚需进一步研究。

刀孢蜡蚧菌的异名是刀孢轮枝菌Verticilliumpsalliotae[5]。刀孢蜡蚧菌被普遍认为是一种虫生真菌,可以寄生蓟马[13]、蚜虫、粉虱、蚧壳虫[14]、柑橘木虱[15]等多种农业害虫,还可寄生根结线虫、孢囊线虫和腐生线虫[16,17],也通过重寄生的方式寄生锈菌[18,14]、疫霉菌等多种植物病原菌[14],在农业病虫害生物防治中有巨大潜力。刀孢蜡蚧菌除了是多种寄主的致病菌,施用到植物上还可以促进植物的生长。Senthil Kumar等[13]报道,在盆栽试验中,在小豆蔻Elettariacardamomum幼苗根区施用刀孢蜡蚧菌的菌剂,与不施菌剂的对照相比,显著增加了豆蔻幼苗的芽长和根长、芽和根的生物量、次生根和叶的数量以及叶片叶绿素的含量。但未见刀孢蜡蚧菌引起植物病害的报道,值得进一步在桑里白粉病的防治上开展应用研究。

高通量测序结果发现,室内保存4个月的病桑叶上桑里白粉病菌的主要重寄生真菌为刀孢蜡蚧菌,相对丰度为 2.10%。此外,还发现极少量的桑白粉病菌,相对丰度为0.24%,以及拟鸟巢菌属Nidulariopsis中的一种拟鸟巢菌N.iowensis,相对丰度为 0.02%。拟鸟巢菌属为担子菌门 Basidiomycota伞菌纲Agaricomycetes真菌,一般在枯枝、落叶、粪肥、土壤等基质上发现,能产生木质素水解酶、纤维素水解酶,可自行完成木质纤维素的降解过程,将作物秸秆转化为真菌蛋白,被认为是目前最理想的木质纤维素降解菌[19]。可能是由于病桑叶室内保存4个月后,开始诱发可以降解叶片纤维素的拟鸟巢菌属真菌的出现。

重寄生真菌尖孢枝孢和刀孢蜡蚧菌寄生桑里白粉病菌的闭囊壳后,闭囊壳内的子囊及子囊孢子均消失,丧失萌发能力,可减少次年病害的初侵染来源。采样及镜检结果发现,全年不施化学药剂的桑园,重寄生现象普遍存在,但每年两次施用杀菌剂和杀虫剂的桑园,仅分生孢子上较容易出现重寄生现象,在采集病叶室内保存2个月内的闭囊壳上未发现有重寄生现象,室内保存4个月后的高通量测序结果发现,重寄生真菌为刀孢蜡蚧菌。说明在自然界中,重寄生真菌与桑里白粉病菌是相互共存的,刀孢蜡蚧菌为桑里白粉病菌上普遍存在的一种重寄生真菌。桑叶是蚕的唯一叶用饲料,田间喷施化学药剂防治桑白粉病引起的农药残留,势必会影响蚕的健康发育。应用重寄生真菌开展病害的防治、通过改善栽培管理模式提高重寄生真菌对桑白粉病的自然控制能力,是值得进一步研究的课题。

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