基于生物矿化机理的自愈合混凝土制备与表征*

冯 君，陈柄丞，卢思怡，胡 玮，许 欣，张 耀

(1. 南京理工大学 瞬态物理国家重点实验室，南京 210094； 2. 南京理工大学 理学院，南京 210094；3. 南京理工大学 材料科学与工程学院，南京 210094)

0 引 言

混凝土具有抗压强度高、耐久性好、价格低廉，生产工艺简单等特点，是目前世界上使用最广泛的建筑材料[1-3]。但混凝土的缺点是容易发生脆性破坏，从而导致强度降低[4]。这种不稳定性使得混凝土在恶劣的环境中很脆弱，尤其是暴露在有害的化学物质中，导致钢筋的腐蚀，影响了混凝土结构的整体性和耐久性，需要巨大的维护成本。根据美国联邦公路管理局的数据显示，美国每年用于混凝土公路桥梁养护的直接成本为40亿美元，而英国每年用于现有混凝土结构养护的成本占其建筑成本的45%[5]。

生物混凝土具有自愈能力，可以减少裂缝的形成和扩展。耐久性较好的混凝土结构，施工维护费用低得多，对于裂缝的开展和修复起着良好的影响[6-7]。通过微生物在混凝土中的矿化作用，产生碳酸钙晶体从而填补裂缝，最重要的是与胶凝材料有良好的兼容性。生物矿化，即微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)[8-9]，已被广泛研究用来提高混凝土的耐久性。混凝土修复剂主要是由一种能够产芽孢的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)组成，这种细菌在恶劣的环境中通常以孢子的形式存在[10-11]，特点是低代谢活动和极长的寿命，目前已知的一些菌株能产生可存活长达200年的孢子[7]。

大多数自愈混凝土的开发研究集中在两方面：一方面是能高效催化产生生物矿化的细菌种类，另一方面是由细菌和钙源组成的愈合剂的固定化问题。研究发现稻壳灰(RHA)混凝土中的芽孢杆菌可以提高混凝土的耐久性[12]。球形芽孢杆菌(B.sphaericus)[13]和巴氏芽孢杆菌(Sporoscarcina pasteurii)[14]用于自愈合混凝土，裂缝宽度愈合能力约为0.3～0.5 mm。芽孢杆菌孢子的尺寸在1 μm左右，但随着混凝土水化反应的进行，水泥凝结过程中孔径的不断减小，影响了细菌的生存空间，导致芽孢的寿命随着混凝土养护时间的增加而减少[1]。因此，研究人员采用各种方法将愈合剂固定在既可以保留微生物又可以混合到混凝土基体中的载体上，枯草芽孢杆菌以轻骨料和石墨纳米片为修复剂载体，能较好地修复混凝土裂缝[5]。另一种方法是将细菌溶液浸渍在轻质骨料中，并用聚合物的涂层对其进行包裹[15]，用该方法配制的自愈合混凝土具有良好的裂缝愈合效率和耐久性。

作为新型先进自愈合混凝土(Nash Conc)系列研究的一部分，本论文的重点是筛选具有良好矿化结晶性能的菌种，为后续自愈合混凝土的制备和性能表征提供依据，研制出裂缝愈合速度快、低温强度回升显著的新型先进自愈合混凝土。首先，对11种可利用的枯草芽孢杆菌菌株在高pH溶液中进行耐碱性测试，以获得耐碱枯草芽孢杆菌M9。对微生物诱导碳酸钙沉淀进行了研究，并用SEM和XRD对其进行表征。然后制备并养护自愈合混凝土梁，底部预制约为0.3 mm的裂缝并进行修复。最后，对修补后的试件进行了二次弯曲试验和裂纹填充物物性分析。

1 枯草芽孢杆菌的筛选

在生产自愈合混凝土时，选择合适的菌种作为愈合剂是实现碳酸钙沉淀充填裂缝的关键。Hammes和Verstraete[26]总结了这一简单化学过程的4个控制条件：(1)钙(Ca2+)浓度，(2)溶解无机碳的浓度，(3)pH(25 ℃时pK2(CO)=10.3和(4)成核位点的可用性。对于自愈合混凝土的配制，本部分试图通过提供成核位点和微碱性细菌环境，寻找在MICP中具有良好性能的合适菌种。

1.1 高pH溶液中枯草芽孢杆菌的筛选

为了获得适用于高碱度基质环境的愈合剂，本工作选择了在碱性培养基中用氢氧化钙缓冲溶液研究其生长阶段，以模拟细菌在混凝土中生存繁殖的实际情况。首先选取11株现有的枯草芽孢杆菌在LB培养基(酵母膏15.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠10.0 g/L)中培养，并用Ca(OH)2冲液调节pH至10。在恒温振动培养箱(HZQ-F100，华美仪，中国)中以220 r/min的转速进行对比培养。用OD600(600 nm光密度仪)测定枯草杆菌悬浮液的吸光度，以测定其生长曲线。每隔24 h监测菌液，获得OD600值，开始时OD600值初始化为0。如图1所示，只有枯草芽孢杆菌M9在培养24 h后有明显的生长，其OD值为0.42。48 h时，所有细菌培养物的OD值均增加0.2～0.3。在接下来的24 h内，只有枯草芽孢杆菌M9的OD值达到1.1，其余10株细菌的OD值保持不变。因此，在pH为10的LB培养基中，枯草芽孢杆菌M9(从奶粉中分离)生长最快，表现出最强的耐碱性。

图1 碱性环境下11种枯草芽孢杆菌菌株的菌体浓度历程Fig 1 Concentration history of 11 kinds of B. Subtilis in alkaline medium

1.2 枯草芽孢杆菌M9的矿化沉淀

通过对枯草芽孢杆菌M9在高pH溶液中生长曲线的评价，表明其耐碱性能最好，这是配制自愈合混凝土的基本要求。碳酸钙沉淀能力是影响抗渗水性能的另一个关键因素。因此，本文进行了MICP试验，以评价枯草芽孢杆菌M9修复混凝土裂缝的潜力。

Yang和Robbins使用放射性标记的Ca2+表明，细菌细胞中钙的调节包括依赖于主动和被动运输机制的流入和流出。正常的细胞内钙浓度通常比细胞外浓度低1000倍，被动转运通常是钙内流的原因。另一方面，初级活性钙转运包括以植物类Ca2+-ATPase酶为基础的ATP依赖的泵。这些体系以牺牲能量(ATP)为代价，以电化学梯度运输钙，由于质子吸收，导致pH局部增加。钙离子浓度的增加形成了理想的局部沉淀微环境，使碳酸氢盐平衡发生变化，进而导致体相介质pH升高。

MICP过程是利用细菌周围培养基中溶解的CO2的新陈代谢。在给定的反应环境下，反应体系中的碳酸盐浓度与溶解无机碳浓度和pH值有关。同时，无机碳浓度依赖于温度、湿度和二氧化碳分压等环境参数。在等式中(1)～(4)，二氧化碳在标准大气压和25 ℃下溶解于水中的平衡反应。

CO2(g)↔CO2(aq)(pKH=1.468)

(1)

CO2(aq)+H2O↔H2CO3(pK=2.84)

(2)

(3)

(4)

(5)

为了定量评价枯草芽孢杆菌M9的矿化沉淀能力，间接测定碳酸钙的沉淀量，步骤如下：首先将培养皿上的枯草芽孢杆菌M9菌株小心地移至超净台上的液体培养基中，然后将装有菌液的试管置于37 ℃下的振荡培养箱中放置24 h，之后加入过量的乳酸钙继续摇床24 h，观察液体中矿化反应引起的悬浮物。用离心机将矿化沉淀物从溶液中分离出来后，加入过量的盐酸，观察二氧化碳气泡的产生。

收集了MICP过程中溶液形成的沉淀，并用扫描电镜(SEM)对其进行了物相分析。将沉淀物在60 ℃的温度下洗涤和烘干24 h，镀膜后进行扫描电镜观察。图2中的扫描电镜测试结果表明，微生物矿化沉淀产物为方解石形状的碳酸钙。

图2 微生物矿化沉淀产物的SEM照片Fig 2 SEM image of microbial-induced calcite precipitation

微生物诱导的碳酸钙颗粒粘结在一起，这是由于细菌成核位点和官能团调控的共同作用，导致MICP过程中碳酸盐晶体的生长较为复杂。晶体尺寸约为3 μm，呈正六面体结构，晶粒大小不均匀，有片状或单晶状。

采用D8 ADVANCE X射线衍射仪，Cu-kα辐射(λ=0.15418 nm)，在40 kV、40 mA条件下对矿物粉末进行了X射线物相分析。沉淀物的XRD衍射谱如图3所示，由JADE6.0软件的数据分析表明，MICP产生的白色沉淀是碳酸钙。

图3 微生物矿化沉淀产物的XRD图谱Fig 3 XRD spectra of microbial-induced calcite precipitation

1.3 枯草芽孢杆菌M9的特性研究

为了研究枯草芽孢杆菌M9的萌发特性及生长情况，每隔4 h取细菌溶液样品，分别用分光光度计(Biodrop duo, Shujun Instrument)和pH计(UB-7, Sartorius)测定其吸光值和pH值。

细菌溶液是以液体培养基在37℃条件下摇床获得，测试结果如图4所示。枯草芽孢杆菌M9在前16 h内生长迅速，24 h进入稳定期。吸光值OD600收敛于2.0左右，溶液的最终浓度约为108cfu/ml，与文献报道的值相符[18]。通过两曲线对比可发现，吸光值从增加到稳定这一阶段与pH值变化相一致，即枯草芽孢杆菌M9的萌发生长情况与其溶液pH改变相似，最终溶液pH约为9.2，接近混凝土断面测得的pH值(～10)。此外，弱碱性环境适合细菌诱导碳酸钙沉淀[25]。

图4 枯草芽孢杆菌的生长曲线及pH情况Fig 4 Growth profile and pH of Bacillus subtilis M9 stain medium

用原子力显微镜(AFM)观察细菌的微观形态。将枯草芽孢杆菌M9菌株在云母片上刮平，制得枯草芽孢杆菌M9样品。通过Nanoscope Analysis用于数据分析，三维示意图如图5(a)所示。图5(b)为枯草芽孢杆菌的垂直投影(10 μm×10 μm)，可以看出此时细菌的轮廓更加清晰，此时细菌的长度约为2.36 μm，直径约为0.85 μm，这与文献报告相似[18,21]。

2 自愈合混凝土的制备

2.1 微生物制剂的制备

应按微生物培养法对具有矿化沉淀能力的细菌冻干粉进行活化，步骤如下[27-28]：

(1)培养基配制。培养基各个成分如表1；(2)培养基及器皿灭菌。将实验所需的所有器皿(如玻璃平板、离心管)，与培养基一起放入高压锅中在121 ℃下高温灭菌20 min；(3)倒平板。在含有琼脂粉的培养基冷却凝固前，在超净台内按照常规的微生物培养平板制备方式制备细菌活化需要的琼脂平板；(4)细菌活化。取出保存在-80 ℃冰箱的菌种，用液氮保藏直接放入室温下的培养基放入温水中，待变成液体状态；若细菌呈现冻干粉状态，则需要取1 mL培养基溶液使其变成液体状态；(5)细菌悬浮液涂平板。在酒精灯上对镊子进行消毒；(6)封口以及恒温培养。将接种后的平板利用封口膜封住，防止染菌。封口完成后将平板置于恒温培养器中在 37 ℃下恒温培养24 h。

图5 原子力显微镜下枯草芽孢杆菌M9菌株的形貌Fig 5 AFM image of Bacillus subtilis M9 strains

表1 LB培养基成分配比

2.2 混凝土浇筑成型

为了生产自愈合混凝土，需要为细菌设计生态位，使其占据一定的空间环境，包括食物、庇护所，以供其生存和繁殖。三萜皂甙引气剂，可降低混凝土中的水表面张力，其设计初衷是为了更好地分散和防止混凝土渗水[29]。它引入了大量的微气泡，直径为50～100 μm，为微生物提供了合适的空间[30]。

传统的砂浆混凝土材料容易发生脆性破坏，通常需要预埋钢筋或纤维来克服这类问题。纤维对混凝土基体的贡献始于裂纹的出现，由于连接裂纹截面的纤维提供了更好的应力传递，使得混凝土开裂后继续提供应力，并阻止裂纹的进一步扩展[31]。为了更好地评价纤维混凝土的裂缝愈合特性，本文制备的纤维混凝土在弯曲条件下产生理想的预制裂缝，采用的是聚乙烯醇(PVA)纤维，与水泥浆体具有良好的相容性而备受关注[32]。

将细砂、水、水泥、粉煤灰、PVA纤维和菌液、钙源组成的微生物自愈剂混合制成40 mm×40 mm×160 mm的混凝土砂浆试件。混凝土配合比如表2所示，其中硅酸盐水泥(P.I42.5)为胶凝材料，粉煤灰为矿物活性细掺合料。水胶比为0.25，砂胶比为0.45。改性PVA纤维由中国开元化工股份有限公司生产，长度12 mm，直径26 μm，拉伸强度1 000 MPa，杨氏模量8 GPa。为了改善纤维增强基体的流动性，还添加了高性能聚羧酸高效减水剂[33]。

表2 自愈合混凝土配合比

为保证裂缝处有足够的愈合剂，浇筑时用细菌溶液代替10%的水溶液，以保证较高的微生物浓度[34]，细菌溶液为培养24 h后，进入稳定期的状态，稀释后的细菌溶液浓度为2.1×107cells/ml。自愈合混凝土的具体搅拌程序如下。首先，将引气剂和减水剂加入水中，充分搅拌30 s；再将水泥、粉煤灰和搅拌后的水投入搅拌机内先慢搅60 s，再快搅30 s；在搅拌期间，根据砂浆的流动性判断是否需要再加入适量的减水剂，等待出现流动性较好的砂浆状态时，再加入乳酸钙和砂子，继续慢搅60 s，快搅30 s；最后加入PVA纤维，搅拌最后一个流程，慢搅60 s，快搅30 s；将拌制好的混凝土装入40 mm×40 mm×160 mm的标准三联模中，在振动台上振实、抹平。以60 s为一个流程，振动两个流程，以防止和泥土出现分层、离析现象。试件成型后，在混凝土表面覆盖一层塑料薄膜以防止水分流失，并在(20±5)℃的环境中静置一昼夜。然后对混凝土进行编号、拆模，按照混凝土养护标准，在相对湿度为95%以上的标准养护条件下继续养护13 d。

3 裂缝密封性评估

3.1 预制裂纹

混凝土结构中的裂缝是由机械荷载或收缩引起的。虽然人工插入薄板形成的裂缝看起来比较均匀，形状规则，但裂缝表面与实际情况并不一致，无法评价纤维桥接效果的愈合情况。所以本文采用三点弯曲试验，使混凝土梁从底部产生一条裂纹，沿着梁顶方向扩展，更符合工程实际情况。

使用万能试验机进行三点弯曲试验。支承梁跨度为12 cm，载荷单元通过位移控制作用于梁的中心，用伸长计记录裂纹张开位移(CMOD)。为了保证准静态加载条件，垂直加载速度为0.1 mm/min。记录每次弯曲试验的Load-CMOD曲线，直到最终CMOD达到0.3 mm。然后反向卸载，直到负载返回到零。抗弯强度可通过公式(6)得到，

(6)

式中：F是峰值荷载，L是跨度，b和h是梁截面的宽度和高度。

6个梁试件的抗弯强度范围为3.63～4.88 MPa，如表3所示。1～3号试件属于第一批，4～6号试件属于第二批，弯曲强度略有差异。一般来说，经过14 d养护后的自愈合混凝土具有较高的抗折强度，符合建筑工程的正常要求。

表3 自愈合混凝土梁弯曲强度

3.2 裂纹修复

在弯曲试验后，仔细收集了6个裂纹梁试件，这些试件底部最大裂缝宽度约为0.3 mm。Wiktor和Jonkers[34]将砂浆样本浸泡在水下以修补裂缝。但水阻止了细菌从大气中自由获取氧气和二氧化碳，这是化学反应(1)～(4)所表明的MICP的关键因素。本研究通过向裂隙区域喷洒乳酸钙溶液，改善裂缝表面孢子的生存环境，使裂缝表面的孢子更好地萌发和繁殖。在养护修复期内，将预制裂纹的试样放置在温度为(35±2)℃，相对湿度≥95%的室外养护箱中，并保持一定的通风，提供充足的O和CO2，为细菌提供一个相对理想的环境。

图6是养护修复28 d后的自愈合混凝土梁试件，裂缝宽度最大的梁底(～0.30 mm)是自愈评价的重点。幸运的是，观察到白色碳酸钙完全填补了梁底的裂缝。左边的照片让我们可以更近距离地看到完全修复的裂缝。在愈合过程中，显微镜记录裂纹部分封闭的状态。值得注意的是，裂纹两侧形成的晶体以不同的速度填充裂隙，即一侧可能积累更多的矿物，而另一侧的晶体较少。在右边的照片中，在微生物砂浆样品表面清晰可见CaCO3晶体，填充了弯曲形成的主裂纹和表面孔隙，裂纹修复宽度在0.26～0.32 mm之间，这已在文献中报道过[35]。

图6 试件裂纹自修复效果Fig 6 Crack sealing of specimen sample

3.3 抗折强度评估

由于方解石晶体本身具备较高的强度，人们相信通过用方解石修补裂缝的方式，自愈合混凝土可以恢复一些强度[36]。预制裂纹自愈合28 d后，对梁试件重复进行三点弯曲试验，以测试因自愈合而恢复的抗弯强度。由于裂缝是在养护半个月后产生的，在裂缝愈合过程中仍可能会有一定的水泥水化。Wang等[37]测试了没有添加愈合剂的砂浆混凝土，没有发现明显的强度恢复。因此我们可以认为，由于混凝土试件的自愈能力，重复弯曲试验可以评估修复后的混凝土试件的恢复抗折强度。

获得了第二次弯曲强度，并与第一次弯曲强度和剩余弯曲强度进行了比较，如表3所示。图7描述了三点弯曲试验和自愈过程中的强度变化。所有试件经微生物修复后均表现出一定的强度恢复，如2号、5号和6号试件的强度恢复到0.33～0.75 MPa。与剩余强度相比，这三种试件的强度恢复率均在15%以上。

图7 弯曲强度的恢复情况Fig 7 Flexural strength regain

在强度恢复现象最明显的情况下，2号试件的加载、卸载和再加载响应如图8所示。在达到峰值荷载后，混凝土受拉破坏产生裂缝，应力突然下降，之后由纤维继续承担，最后进入平稳期。当CMOD达到0.3 mm时，将MTS机调整为以0.1 mm/min进行卸载，Load-CMOD曲线呈下降趋势，直到约0.26 mm。自愈合梁修复后，再次进行加载试验。值得注意的是，再次加载响应下降段相对较平缓，峰值荷载远大于首次弯曲结束时的残余荷载。由此，我们可以认为混凝土的自愈合作用，使得混凝土强度得到一定的提升。

图8 两次三点弯载荷下试件的力学响应Fig 8 Mechanical response of repeated 3-point bending load

方解石的析出填充了裂隙，使得断裂面的强度得到一定的恢复。利用微生物诱导碳酸钙沉淀来修复裂缝，宏观上有助于结构强度的恢复。此外，还对拔出后的PVA纤维进行了SEM测试。图9是纤维表面细节图，显示了纤维的损伤程度和附着情况。放大10 000倍后，可以清晰的看到纤维表面的划痕，表明纤维与其周围基体之间存在滑移和剪切摩擦相互作用。同时纤维表面有零散的碳酸钙晶体析出，这是因为MICP的自愈合机制，纤维-基体界面附近的微裂纹也得到了修复。

图9 PVA纤维拔出后的扫描电镜图像Fig 9 SEM image of PV A fiber after pullout

3.4 裂纹填充矿物的表征

用扫描电镜分析从断口采集的微量矿物样品，从图10(a)～(c)中可以看出，方解石是碳酸钙最主要的沉淀形式，这些晶体按照一定的顺序堆叠排列，规则整齐，但仍有一些是不规则六面体及类球状颗粒，且颗粒尺寸相对更大，如10(d)所示。在碳酸钙的沉积过程中，许多外界条件都会直接影响碳酸钙的晶型和形貌[38]，比如说不同外加钙源，其中含有的不同官能团会对碳酸钙形貌产生一定的影响；同时在混凝土中所处的环境，过高的碱性环境也会导致不同类型的碳酸钙产生。

图10 裂纹填充物的电镜照片Fig 10 SEM image of crack filler

如文献[19]所述，微生物的代谢活动导致碳酸盐浓度和pH的升高，进而促进CO2向碳酸盐的转化。随后Ca(OH)2与CO2的碳化作用也促使了方解石的析出，从而封闭了裂缝。上述两个化学反应方程式为：

CaC6H10O6+6O2→CaCO3↓+5CO2+5H2O

(7)

Ca(OH)2+CO2→CaCO3↓+H2O

(8)

随着晶体的形成，细菌在成核处的生存环境变得非常恶劣，即与水、营养和空气隔绝。在图11中，可以看到在碳酸钙晶体表面有一些类似于细菌形状的印记，可以猜测这是细菌矿化沉淀后移动留下的痕迹。这一现象也被前人所记录，为碳酸钙矿物的沉淀演变提供了重要依据。

图11 生物矿化作用对细菌的封装Fig 11 Encapsulated bacteria due to biomineralization

4 结 论

本文对自愈合混凝土制剂的菌剂进行了筛选，进而制备了一种自愈合混凝土。对11种有效的枯草芽孢杆菌在相对较高pH条件下的生长周期进行了吸光度OD600测定。选用耐碱枯草芽孢杆菌M9作为自愈合混凝土的配制剂。通过三点弯曲试验，在底部预制产生约为0.3 mm的裂缝。通过扫描电镜对矿物沉淀进行分析，以及修复后梁的反复弯曲试验，对裂缝愈合情况进行了评价。得出以下几个结论：

(1)微生物诱导碳酸钙沉淀的研究结果表明，与通过化学方法得到的碳酸钙晶体相比，微生物诱导形成的碳酸钙，为稳定的方解石晶体且更加致密。

(2)对自愈合混凝土梁进行三点弯曲试验，最大抗弯强度为4.2 MPa。自修复养护28 d后，对自愈合梁进行第二次三点弯曲实验，抗弯强度提高0.34 MPa，强度恢复率约14%。抗弯强度的恢复来自于裂缝的填充和纤维-基体界面粘结的修复。

(3)弯曲梁的断裂面呈荧光状边缘轮廓，与细菌旺盛区相对应。这主要是由于混凝土表面碳化导致pH值偏低，而内侧混凝土基质pH值较高且相对干燥的环境，不利于微生物的生存。因此，随着裂纹深度的增加，愈合速率急剧下降。这一缺陷严重阻碍了微生物自愈技术在实际工程中的应用。

(4)对自愈合混凝土中析出的裂纹填充矿物进行了扫描电镜测试。主要是呈六边形的碳酸钙晶体，并有细菌留下的清晰印记。

(5)在扫描电镜测试中发现PVA纤维由于剪切摩擦和滑移而出现划痕。拔出后的纤维表面附着碳酸钙晶体，表明纤维-基体粘结界面正在修复。