COVID-19恢复期晚期妊娠与未妊娠患者免疫功能的差异分析

金志珊，吴江华，冯地路，夏 霖，张青苗，汪宏波

(华中科技大学同济医学院附属协和医院 a.妇产科;b.血液内科，武汉 430022)

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染而引起的急性呼吸道传染病，在我国属于乙类传染病，甲类管理，于2020年3月11日由WHO定义为疫情全球大流行。COVID-19为突发新型冠状病毒，对其流行病学的了解不够详细，现全球疫情肆虐，迫切需要COVID-19年龄及性别流行病学相关研究[1]。目前年轻女性及妊娠女性的流行病学数据尚无明确报道，其免疫状态尚不清楚。根据现有报道[2-3]及华中科技大学同济医学院附属协和医院收治的26例COVID-19孕妇的预后分析，COVID-19孕妇均以轻型、普通型居多，重症病例少见，危重及死亡未见相关报道[4]，且孕产妇预后良好。但是，同龄COVID-19感染的未妊娠女性有死亡的相关报道。女性在妊娠状态下，其免疫状态不同，感染SARS-CoV-2后的反应及预后亦不同，其免疫功能的变化对COVID-19的治疗可能有重要意义。本研究通过检测COVID-19感染恢复期的晚期妊娠患者与未妊娠患者外周血中淋巴细胞亚群及细胞因子变化，初步探讨了解COVID-19感染合并晚期妊娠患者免疫状况的变化规律。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月30日至4月10日华中科技大学同济医学院附属协和医院收治的晚期妊娠合并COVID-19感染并成功分娩的患者18例，年龄24～40岁，平均(29.67±4.80)岁;选取同年龄段合并COVID-19感染的未妊娠女性17例，年龄24～41岁，平均(31.2±7.08)岁。两组患者的排除标准：合并既往血液系统疾病或恶性肿瘤疾病;3个月内使用过可使血细胞形态明显改变药物。

1.2 相关定义 核酸检测转阴时间：患者从发病开始到检测到第一次核酸转阴天数(核酸转阴患者至少在本病区核酸检测2次均为阴性，回顾第一次核酸检测呈阴性时间，如患者入院后核酸已为阴性，无法明确转阴时间，则去除该病例入组核酸转阴时间的统计)。住院天数：住院当天开始，根据我国诊疗指南达到出院标准出院当天为止，且全部晚期妊娠患者均生产后恢复出院。恢复期：根据2020年3月3日国家卫生健康委办公厅发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》试行第7版，患者达到出院标准：(1)体温恢复正常3天以上;(2)呼吸道症状明显好转;(3)肺部影像学显示急性渗出性病变明显改善;(4)连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测阴性(采样时间至少间隔24h)。实验组为终止妊娠前达到出院标准，需在恢复期终止妊娠，采血时间为终止妊娠前;对照组为达到出院标准的未妊娠女性患者，采血时间为出院前。

1.3 仪器及主要试剂 流式细胞仪(BD公司，FACS Calibur)及CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45RA、CD62L、TCR γδ检测试剂(流式细胞法-FITC/PE/PerCP/APC)。

1.4 方法 临床数据收集，包括鼻咽拭子核酸，细胞因子六项(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ6)，淋巴细胞亚群分析(比例)。此外，行淋巴细胞绝对值计数的3组对象均清晨空腹抽取静脉血2ml，EDTA抗凝。应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群：CD3+(T淋巴细胞总体比例)，B淋巴细胞(CD19+)，NK细胞(CD3-CD56+)，NKT细胞(CD3+CD56+)，γδ T细胞(TCRγδ+)，中枢记忆性T细胞[CM，EMRA(CD62L-/CD45RA+)];幼稚T细胞(NAIVE，CD62L+/CD45RA+)。

1.5 统计学处理 采用SPSS25.0软件，采用两组间独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 COVID-19感染未妊娠与晚期妊娠女性恢复期外周淋巴细胞亚群比例及细胞因子 COVID-19感染未妊娠与晚期妊娠女性的病毒转阴天数和住院天数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。两组的外周淋巴细胞亚群比例(CD3+总T淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞比值、CD4+T/CD8+T)以及细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 COVID-19感染未妊娠与晚期妊娠女性恢复期外周淋巴细胞亚群比例及细胞因子测定

2.2 COVID-19未妊娠与晚期妊娠女性恢复期外周血淋巴细胞亚群绝对值对比分析 取3对COVID-19感染未妊娠与晚期妊娠女性恢复期外周血淋巴细胞亚群绝对值对比分析。结果显示，晚期妊娠女性的自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)数显著低于未妊娠女性(P=0.005)，晚期妊娠女性的自然杀伤T细胞(natural killer T cells,NKT)高于未妊娠女性(P=0.015);两组的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及γδT细胞均无统计学差异(图1)。

图1 COVID-19未妊娠与晚期妊娠女性恢复期外周血淋巴细胞亚群绝对值对比分析A：CD3+T细胞;B：CD4+T细胞;C：CD8+T细胞;D：γδ T细胞;E:NK细胞;F:NKT细胞

2.3 COVID-19感染恢复期未妊娠与晚期妊娠女性外周血淋巴细胞CD4+T及CD8+T细胞亚群绝对计数 两组的CD4+T及CD8+T细胞亚群计数(CM、EM、EMRA、NAIVE)无统计学差异(图2)。两组的CD4+及CD8+的亚群比例比较，无统计学差异。

图2 未妊娠组与晚期妊娠组COVID-19感染恢复期

3 讨 论

妊娠时女性处于一种特殊的免疫耐受状态，为了防止妊娠期间的胎儿排斥反应，需对胎儿免疫耐受;同时，母体免疫系统保护胎儿免受有害的内源性和外源性抗原的影响，包括与病毒和细菌感染有关的抗原。正常妊娠期，通过抑制T细胞介导的免疫而促进母体环境对胎儿的维持[5],大多数细胞因子水平降低，特别是在妊娠最初的20周。妊娠早期外周血CD4+细胞亚群随着HCG上升而下降，孕10～40+周CD4+细胞逐渐回升[6]。正常妊娠中晚期孕妇与未孕妇女比较，外周血中CD4+T淋巴细胞减少，CD8+T淋巴细胞基本不变，NK细胞有一定程度的下降[7]。目前还不清楚这种被抑制的免疫系统是否转化为妊娠期间感染风险的增加。

COVID-19感染者的淋巴细胞比例和数量减少，尤以CD4+和CD8+T淋巴细胞数显著减少为主，部分患者炎性细胞因子，如IL-6表达上调等[8]。本研究显示，COVID-19感染恢复期晚期妊娠孕妇与同龄未妊娠女性的T淋巴细胞数量、比例，CD4、CD8亚型计数及比例，细胞因子六项比较，均无明显统计学差异。CD4+T细胞和CD8+T细胞均为异质性细胞群，可分为中枢记忆T细胞(CM)，效应记忆T细胞(EM)，终末效应T细胞(EMRA)，幼稚T细胞(NAIVE)。本研究显示，CM、EM、EMRA、NAIVE在COVID-19感染后女性中，其变化与妊娠无相关性。

本研究结合武汉同济医院[2]及武汉市妇幼保健院[9]的研究，均没有孕产妇死亡报道，且孕产妇预后均良好。有专家认为，COVID-19患者病情突然加重，快速出现呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭可能与“炎症因子风暴”相关，患者血浆中IL-2、IL-7、IL-10、G-CSF、IP-10、MCP-1、MIP-1A和TNF-α显著升高[10]。肺部免疫细胞处于过度活化状态，大量免疫细胞的浸润和组织液的聚集会阻塞肺泡与毛细血管之间的气体交换，从而导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[11]。妊娠女性呈免疫抑制状态，免疫细胞难以过度活化，故而炎症因子风暴相对弱，ARDS出现情况少见。妊娠时期特殊的免疫状态，可能让妊娠女性处于轻型及普通型，避免了向重型及危重型转变。华中科技大学团队前期研究发现，重症患者的多种细胞因子仅在某一段时间内有显著上升，而在其他时间段与轻症组无明显差异[8]。本研究针对的是恢复期病例，可能其细胞因子的改变发生于发病早期，而恢复期患者的细胞因子已处于基本正常水平。本研究中单独恢复期的两组间细胞因子的比较无明显差异，与以上研究相符。

无论对于妊娠或非妊娠女性，尽早了解患者急性期的细胞因子状态，及早进行相关的免疫治疗，可能避免轻型和普通型发展成为重型或危重型。此结论还需更多的妊娠女性COVID-19急性期相关研究。本研究进一步结果显示，COVID-19感染后恢复期晚期妊娠与同龄女性比较，T淋巴细胞亚群无明显差异，NK细胞绝对计数减少，NKT细胞绝对计数增加。NK细胞具有细胞毒效应，无需抗原预先致敏就能杀伤靶细胞。COVID-19感染患者较未感染者，NK细胞显著下降[12]，考虑原因：(1)患者本身存在免疫功能缺陷(孕妇本身NK水平相对低);(2)NK细胞对抗病毒发生消耗，未能得到及时补充;(3)病毒感染机体后，侵犯免疫系统，破坏NK细胞或抑制NK细胞的生成[12]。随着研究深入，NK细胞在适应性免疫中作用不断展现，在一定情况下具有抑制病毒特异性T细胞的抗病毒作用。

NKT细胞是一群不同寻常的T淋巴细胞，活化的NKT细胞具有介导天然免疫和特异性免疫应答的功能，直接或间接参与机体的免疫应答，发挥杀伤活性。一方面，NKT细胞活化可产生大量细胞因子，参与抗感染;另一方面，可活化其他淋巴细胞，参与抗感染。在病毒性肝炎的研究中，如NKT细胞或CD1d缺失，或者CD1d递呈脂类抗原缺陷，HBV特异性的T细胞和B细胞应答都会消失，病毒清除延迟。且胸腺肽α-1可富集NKT细胞，帮助清除感染病毒的细胞。然而，NKT在COVID-19中的角色不明，未见相关报道。

以往认为,孕妇抵抗力低，即对病毒的清除能力弱，病程时间较长。本研究中，COVID-19感染晚期妊娠女性与同龄女性的SARS-CoV-2的转阴时间、住院时间无明显差异，且住院时间包括晚期妊娠终止妊娠后恢复的时间。表明妊娠对于COVID-19来说并无劣势，但孕产妇的心理状态是否对病情的恢复有影响[13]，有待进一步研究。本研究显示，较COVID-19感染的非妊娠女性，COVID-19感染晚期妊娠NK细胞绝对计数减少，NKT增加，但其是否改变了对病毒的清除能力，以及COVID-19对子代的影响，尚需进一步探讨。目前针对COVID-19无特效药物，中西医均给予免疫调节抗病毒药物[14]。最近研究发现，MSCs移植改善COVID-2019患者的预后可能是通过调节炎症反应[15]和促进组织修复与再生。故针对性免疫治疗可进一步了解是否对NK及NKT细胞有调节，为后续治疗机制和临床用药提供一定的参考。

妊娠合并COVID-19感染的危重症人数相对少，可能是因早期发病时免疫功能抑制而表现为细胞因子风暴弱，故表现为轻症及普通型较多，危重症少。妊娠合并COVID-19感染者对病毒的清除能力与同龄女性无明显差异，是否得益于NK细胞减少的基础上，继发NKT细胞的增加，需后续进一步研究。本研究仅针对恢复期患者免疫功能的研究，存在一定的偏差，不能代表急性期免疫应答的情况。本研究样本量少，属于回顾性研究,且因病例数限制，未进行不同孕周的淋巴细胞亚群的比较。