酸与碱处理对海带多糖提取及其抗氧化活性的影响

陈文宁， 郑娟霞， 月金玲， 杨 莉， 王琤韦华

（江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330013）

海带是我国一种高产的海藻类作物， 其含有丰富的维生素、矿物质、多糖类物质等营养成分，其中海带多糖是重要的功能性物质 （叶竹秋，2001）。 研究发现，海带多糖具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多种生理活性 （Chen 等，2010；Shuai 等，2010；Li 等，2008；Wang 等，2008；Athukorala 等，2007），是目前的研究热点之一。 海带多糖可用作动物生产中的饲料添加剂， 但商品海带多糖的生产工艺复杂，成本高，因此，寻找一种简单提取海带粗多糖的方法， 可以推进其在动物生产上的应用。 本试验通过柠檬酸提取法和碱提取法分别提取海带粗多糖， 比较二者的多糖得率和抗氧化活性，为海带多糖更好地应用于畜牧业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 试验材料 干海带购于江西省南昌市市场，粉碎待用。

1.1.2 试验试剂 无水乙醇、浓硫酸、苯酚、柠檬酸、碳酸钠、七水合硫酸亚铁、过氧化氢、盐酸、氯化铁、 葡萄糖、 邻菲咯啉、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ），均为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器 本试验所使用仪器规格见表1。

表1 试验所需仪器

1.2 试验方法

1.2.1 海带多糖提取工艺流程

1.2.1.1 柠檬酸提取法工艺流程 本试验参考卢茳虹等（2012）研究得到的试验方法进行提取，将干海带粉碎，柠檬酸溶液（pH=2）浸取，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钾调节中性pH，浓缩，在4 ℃静置8 h 进行3 次醇沉（乙醇最终浓度为80%），再进行抽滤得到沉淀物，用无水乙醇洗涤脱水，用干燥箱烘干得到海带粗多糖。

1.2.1.2 碱提取法工艺流程 本试验参考原泽知等（2010）研究得到的试验方法进行提取，将干海带粉碎，5% Na2CO3溶液浸取，抽滤，合并滤液浓缩，在4 ℃静置8 h 进行3 次醇沉（乙醇最终浓度为80%），再进行抽滤得到沉淀物，用无水乙醇洗涤脱水，用干燥箱烘干得到海带粗多糖。

1.2.2 粗多糖提取率的计算 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法（周德庆，1986）。 精密称取烘干后的葡萄糖100 mg，加入适量水定容至1 L，配制成浓度为100 mg/L 的葡萄糖标准溶液。 分别吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖标准溶液置于试管中，用蒸馏水将溶液补至2 mL，加入1 mL体积分数为6%的苯酚溶液，迅速加入浓硫酸5 mL，充分摇匀再静置20 min， 在波长490 nm 下测定OD 值，绘制标准曲线。 各取酸提和碱提得到的海带粗多糖样品0.5 g，定容到100 mL，然后取稀释溶液2 mL 加入测定管中，重复上述操作5 次。 空白管以超纯水代替待测样本， 依据葡萄糖标准曲线方程计算海带粗多糖样品的多糖得率。

多糖得率/%=提取液中多糖含量/所用海带总量×100。

1.2.3 铁还原抗氧化能力（FRAP）测定 准确称取七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0.0278 g，溶于超纯水定容至1 L，配成浓度0.1 mol/L 的FeSO4·7H2O 标准母液。取FeSO4·7H2O 标准母液0.1 mL，用超纯水稀释至浓度为0.1 mmol/L 的标准工作液。 用0.1 mmol/L 的标准工作液配制FeSO4溶液的浓度梯度， 包括浓度为0.01、0.03、0.05、0.07、0.1 mmol/L 的标准溶液。 取各浓度标准溶液各0.2 mL，加入1.8 mL TPTZ 工作液，混匀，于37 ℃水浴保温10 min，593 nm 测定吸光值， 绘制标准曲线。 依据FeSO4标准曲线方程计算海带多糖样品总抗氧化能力，重复5 次。空白管以超纯水代替待测样本，其他相同。依据FeSO4标准曲线方程计算海带多糖样品总抗氧化能力。 样品的抗氧化能力以FRAP 值表示（1 FRAP=1 mmol/L FeSO4）。

1.2.4 羟自由基的清除能力 取1 mL 0.75 mmol/L的邻菲咯啉溶液于试管中，分别加入2 mL 的pH

7.4 磷酸盐缓冲液和1 mL 的纯水， 充分混匀后，加0.75 mol/L 硫酸亚铁1 mL 混匀， 加0.01%的过氧化氢1 mL， 于37 ℃恒温水浴60 min，于536 nm 下分别测其吸光度（Ap）；再用30%的乙醇1 mL 代替1 mL 过氧化氢，测得吸光度（Ag）。将酸提和碱提得到的海带粗多糖样品配成1.0 mg/mL 的溶液， 取1 mL 代替1 mL 蒸馏水，测得吸光度（As），重复5 次。 羟自由基清除能力的计算公式为：

·OH 清除率/%=[（As-Ap）/（Ag-Ap）]×100。

1.3 数据处理 试验数据选用统计软件SPSS 20.0 进行分析处理，采用多重比较的LSD 法检验不同提取方法下多糖得率和抗氧化活性的差异水平。 试验数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 海带多糖的多糖得率 由表2 可知，柠檬酸提取法得到的粗多糖得率为（15.92±2.36）%，碱提取法得到的粗多糖得率为（6.05±0.81）%，二者之间的多糖得率差异显著（P ＜0.05），经柠檬酸提取法提取的粗多糖含量高于碱提取法。

表2 海带多糖的多糖得率 %

2.2 海带多糖的抗氧化能力 如表3 所示，柠檬酸提取法和碱提取法提取的粗海带多糖的总抗氧化能力FRAP 值分别为0.048±0.004 和0.022±0.012， 且二者之间的多糖得率差异显著（P ＜0.05），说明柠檬酸提取法提取的粗多糖总抗氧化能力强于碱提取法提取的粗多糖总抗氧化能力。

表3 海带多糖的FRAP 值

2.3 海带多糖的羟自由基清除率 如表4 所示，当多糖浓度为1 mg/mL 时， 酸提的海带多糖对·OH 清除率为42.67%，碱提的海带多糖对·OH 清除率为32.03%，说明海带多糖对·OH 有一定清除能力，酸提的海带多糖对·OH 的清除能力显著高于碱提的海带多糖。

表4 海带多糖的羟自由基清除率%

3 讨论

3.1 酸提和碱提的多糖得率 目前， 提取海带多糖的常用方法有水提法、酶提法、酸提法、碱提法等， 使用水提法提取海带多糖时可达10.49%（余华，2006）；使用酶提法可达11.62%；使用酸提法时可达35.10%（周裔杉，2006）； 使用碱提法时可达76.88%（刘秀河等，1999），由此表明，酸提取法和碱提取法的产率相对较高，故本试验选择碱提取法和酸提取法提取海带多糖并对其多糖得率和抗氧化活性进行比较。 结果表明，柠檬酸提取法得到的多糖得率为 （15.92±2.36）%， 这一结果与卢茳虹等（2012）提取得到的多糖得率[（13.19±0.06）%]差异不大。王智荣等（2016）研究了几种常见的酸以及水等提取溶剂提取海带多糖，确定了柠檬酸提取海带多糖的效果最佳，多糖得率最高为12.95%，也与本试验结果相近。而本试验碱提取法提取到的多糖得率为（6.05±0.81）%，与原泽知等（2010）的海带多糖产率2.13%存在差异， 可能由于所取海带部位不同，海带多糖含量有所差异。此外，闵玉涛（2015）比较了水提和醇提两种方法提取海藻多糖的效果，分别为6.00%和7.80%；蔡彬新等（2012）用水提法提取海带多糖，提取率达7.90%；张换等（2013）用纤维素酶提取海带多糖的产率为11.62%； 任状等（2018） 采用超声波协同酶法提取的海带多糖产率为19.40%。 上述方法的提取效果大多弱于柠檬酸提取法，强于或相近于碱提法。因此，柠檬酸提取法较碱提法具有更好提取效果。

3.2 海带粗多糖的抗氧化力 自由基是机体代谢产生的一类氧化性极强的物质，具有攻击生物分子的功能，较高的氧化水平，会发生超氧化化学反应，从而破坏细胞作用及其组织。多数自由基可以诱导DNA 及染色体结构损坏、干扰细胞代谢、破坏蛋白质活性和酶体系，可直接或间接引起慢性疾病及衰老效应（魏梦涛等，2018）。 自由基易与还原性物质发生反应，还原性越强的物质越容易与自由基的强氧化性物质发生反应，清除的自由基越多，其抗氧化活性也就越高，常用FRAP 法测定。 FRAP 值越大，多糖抗氧化能力越强。本试验结果显示，柠檬酸提法和碱提法的海带粗多糖的还原力分别为（0.048±0.004）和（0.022±0.012）。叶文斌等（2016）提取拐枣多糖， 其浓度为2.0 mg/mL 时，FRAP 值为0.94；李秋莹等（2016）研究四种淫羊藿多糖的抗氧化活性，FRAP 值分别为0.166、0.411、0.237、0.236。本试验的结果与此相比，柠檬酸提法和碱提法的海带粗多糖的还原力较弱，但柠檬酸提取法的还原力比碱提法的效果好。

3.3 海带粗多糖的·OH 清除率 ·OH 是机体在新陈代谢中由过氧化氢释放出的破坏性强、 危害较大的一种自由基，其可以直接与糖类、氨基酸、蛋白质和磷脂等生物大分子物质发生反应， 导致细胞膜损伤和细胞大面积凋亡（Xu 等，2011；Shen等，2001），也可以通过氧化碱基，使细胞DNA 结构改变，导致细胞坏死或突变（樊岫珊，2017）。 因此，清除体内代谢产生的过多累积的自由基，有助于维持细胞活性和氧化代谢平衡 （楼兰花等，2003）。 本试验结果显示，当多糖浓度为1 mg/mL时，柠檬酸提法提取的海带粗多糖的·OH 清除率为42.67%，碱提法提取的海带粗多糖的·OH 清除率为32.03%，而贾彦明等（2010）通过碱提取法分离纯化得到海带多糖的多糖浓度为2 mg/mL 时，·OH 清除率为46%， 说明柠檬酸提法和碱提取得到的粗多糖具有一定的抗氧化活性， 都能有效清除·OH。 魏碧娜（2016）提取的海带粗多糖浓度为1 mg/mL 时·OH 清除率为43%， 与本试验酸提的结果相近。 因此，两种提取方法相比较，柠檬酸提取法提取得到的海带多糖的·OH 清除率强于碱提取得到的海带多糖。

4 结论

本试验结果表明，柠檬酸提取法提取海带多糖和其抗氧化活性均优于碱提取法。 因此，柠檬酸提取法更适合于工业生产粗多糖，降低养殖成本。