基于网络药理学的建昌帮姜天麻对偏头痛作用机制研究

★谢宇璐 叶慧 张霞 李家荣 陈海香 叶喜德 彭巧珍（.江西中医药大学 南昌0004；2.萍乡市人民医院 江西 萍乡 7000；.南昌航空大学 南昌 006）

天麻为兰科植物天麻G. elataBI. 的干燥块茎［1］，春、冬季节采挖，其味甘性平，专入肝经，为肝风内动之常用药，又为“偏头痛”之要药，无论寒热虚实均可配伍应用。中医常以天麻单用或随证配伍用于治疗头痛眩晕、癫痫、小儿惊风等证［2］。姜天麻为江西“建昌帮”特色饮片之一［3］，辛温之生姜炮制天麻，可增强天麻镇痛、抗眩晕之效，但对偏头痛的作用机制，目前文献仍属空白。偏头痛，是一种以单侧或双侧搏动性中至重度头痛为特征的慢性神经血管性疾病，发病时并伴有自主神经系统症状［4］。其病机复杂，至今尚未有一致的解释。目前普遍认同的学说有三叉神经血管、血管源学说和神经和炎症介质等学说［5］。近年来基因遗传学说、中枢神经系统学说也被相继提出［6］。

网络药理学是一门基于系统生物学与计算机技术发展起来的新兴学科，在系统生物学、多向药理学等多个学科理论基础上，运用文本数据挖掘、代谢组学和网络可视化技术，系统观察药物对于靶点和疾病网络的干预以及影响，从而揭示多分子药物协同作用对疾病作用机理［7］。而中药及中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点、多途径等特点，契合网络药理学特点。课题组前期围绕姜天麻炮制前后成分变化进行了研究，并鉴定出20个主要差异性成分［8］。为此，本研究依照这些差异性成分，通过网络分析平台，构建药物-成分-靶点-偏头痛关系网，以推测天麻炮制对偏头痛作用机制，为姜天麻临床应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 软件及数据库 软件：Cytoscape 3.6.1软件、R语言统计建模软件（version 3.6.2）、perl脚本解释器ActivePerl（version 5.26.1.2601）。

数据库：Swiss target prediction数据库（http：//www. Swisstargetprediction. ch/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）、DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）、Genencards数据库（https://www.genecards.org/）、KEGG数 据 库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）、Drug Bank数据库（https://www.drugbank.ca/）。

1.2 方法

1.2.1 姜天麻炮制差异性成分的收集 基于前期已分析出天麻炮制后20个主要差异性成分为研究对象。

1.2.2 成分作用靶点预测 通过Swiss target prediction数据库画出化合物结构后进行体内作用靶点预测，并筛选物种为“人”的潜在靶点。

1.2.3 偏头痛靶点收集 通过Genencards数据库，输入关键词“migraine”查找相关的疾病作用靶点，并通过OMIM、DisGeNET等数据库验证。

1.2.4 药物成分靶点与疾病靶点交集 将20种差异性成分的靶点与偏头痛相关基因进行映射，得到成分作用于偏头痛潜在靶点，并制成表格，以供构建网络使用。

1.2.5 网络构建 据“1.2.3”和“1.2.4”的结果，在EXCEL表格中建立药物-化合物、化合物-靶点、靶点-疾病的相互对应关系，在Cytoscape 3.6.1软件中导入network构建网络［9］，再导入type文件，调整网络并完善，得“姜天麻-差异性成分-靶点-偏头痛”网络图，如图1。再运用其插件Network Analyzer计算网络特征，网络中节点（node）表示疾病、药物、化合物、靶点，边（edge）表示疾病-靶点、化合物-靶点以及药物-化合物之间的相关关系。

1.2.6 生物过程和通路分析 靶点GO功能分析基于R语言统计建模软件（clusterProfiler包），对潜在作用靶点进行GO注释和KEGG通路富集分析（p值为0.05，q值为0.05），并将结果以气泡图形式输出［10］，如图2、3。

图1 网络药理图

图2 GO功能分析气泡图

图3 KEGG富集分析气泡图

2 结果

2.1 偏头痛靶点收集 经Genencards数据库收集“migraine”相关的疾病作用靶点，因偏头痛相关靶点过多，故筛选出得分≥1的靶点，总计2 150个。

2.2 药物成分靶点与疾病靶点交集 通过“1.2.4”的靶点映射，在20种差异性成分中找到150个治疗偏头痛潜在作用靶点，如TNF、EDNRA、ESR1、HTR1B、ACE、DRD2、HTR2A等。其中在“1.2.5”项下构建的网络图中degree值前十分别是ADORA1、CYP19A1、TERT、SRD5A1、ESR1、TYMS、SLC6A2、LGALS3、EPHX2、HSP90AA1，见表1。

表1 度值前十的基因

2.3 网络拓扑学属性分析 对姜天麻差异性成分-靶点-疾病网络的拓扑属性分析发现，构建网络的节点度服从幂律分布，提示其符合生物网络一般特性［11］，聚集系数(Clustering Coefficient)为0，网络中心度(Network centralization )0.809，网络异质性(Network heterogeneity)为1.354，平均相邻节点数目(Avg. number of neighbors)13.186，特征路径长度(Characteristic path length)2.061，即网络路径长度为2步，说明整个网络具有良好的稳定性。

2.4 生物过程和通路分析 GO功能分析结果主要涉及amide binding(酰胺结合）、peptide binding（肽结合)、G protein-coupled amine receptor activity(g蛋白偶联胺受体活性）、catecholamine binding（儿茶酚胺结合)、endopeptidase activity(内肽酶活性）等148个条目。KEGG 富集分析共映射出17条信号通路（如表2）。其中靶点数排名前五的分别是神经活性配体-受体相互作用、Ca2+信号通路、cAMP信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、内分泌阻力等。而EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、内分泌抵抗、铂耐药性等通路与肿瘤、癌症相关。

表2 KEGG通路信息图

3 讨论

偏头痛生理病理过程复杂，涉及血管、神经、免疫、炎症介质、基因遗传、脑结构和功能异常等［12］。本研究发现姜制天麻后20个主要差异性成分，对偏头痛的作用存在150个潜在靶点，其中TNF、MAOB、MAOA、ACE、TRPV1、PTGS2、NOS2、MMP9、HTR2C、HTR2B、HTR2A、HTR1B、PIK3CA、PRKCG、PRKCA、VEGFA等基因，均与偏头痛的病理生理过程密切相关。偏头痛在发病期间，体内TNF、MMP9、PKC、NO水平明显偏高。蛋白激酶C（PKC）属于丝氨酸和苏氨酸激酶，PKC的激活是介导脑损伤的关键环节［13］，通过抑制PKC水平可明显缓解偏头痛［14］。NO增多会扩张血管并引起神经源性炎症反应，引发血管扩张性头痛，一氧化氮合酶（NOS）可介导内源性NO的合成［15］，同时，NOS抑制剂可明显缓解偏头痛症状［16］。5-羟色胺（5-HT）含量升高，会引发脑血管收缩，为偏头痛发病的关键原因。瞬时感受器电位香草酸受体（TRPV1）多表达于神经细胞膜上，在诱发炎性疼痛过程中作用显著［17］，这其中的原因，可能是由于激活了巨噬细胞系统，而释放5-HT、PGE、BK及CCL2等介质，参与偏头痛发病［18］。血管紧张素转换酶(ACE )是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的关键酶，可将血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）转换为血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）［19］，后者可收缩血管和升高血压，参与偏头痛发作。AngⅡ受体阻滞剂和ACE 抑制剂能较好预防偏头痛发作［20］。基质金属蛋白酶9（MMP9）可损坏血脑屏障，造成脑出血和脑水肿，且对神经元有一定毒副作用［21］，MMP9也是引发炎症反应的重要物质。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2 ）是前列腺素生物合成的核心酶，前列腺素是偏头痛的重要致痛因子，其可能的作用机制是扩张脑血管［22］。研究发现降低PTGS2基因的表达量，可减少体内前列腺素的合成，从而缓解脑血管的扩张过度，消除神经源性炎症从而达到治疗无先兆型偏头痛的目的［23］。

姜天麻差异性成分中存在多巴胺受体（DRD1、DRD2、DRD3、DRD4）与 阿 片 受 体（OPRM1、OPRK1、OPRD1）以及腺苷A1受体（ADORA1）、核因子κB激酶亚单位β抑制剂（IKBKB）、第一类5-羟色胺受体（5-HTR1A、5-HTR1）等基因，这些基因可作用于多种信号通路产生镇痛作用。经KEGG通路富集分析，姜天麻差异性成分主要通过钙信号通路、cAMP信号通路、花生四烯酸代谢、血管内皮生长因子信号通路等通路作用。根据血管源学说，炎症介质的产生，是偏头痛病理生理基础。作用于内皮细胞上的CGRP受体，可通过cAMP通路增加细胞内Ca2+浓度，上调NOS产生NO致平滑肌舒张；同时CGRP 还可经前列环素（PGI2）作用，活化cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路从而达到舒张血管的目的［24］。花生四烯酸代谢能影响疼痛的产生，环氧合酶作用后，其代谢产物PGE1、PGE2 及PGE3加强痛觉感受器对致痛物质的敏感性［25］。姜天麻差异成分的潜在靶点结果显示，差异性成分可通过作用7个靶点（PTGS2、PTGS1、TBXAS1、PLA2G2A、ALOX5、EPHX2、PLA2G4A）进而影响花生四烯酸的代谢。

4 总结

本实验网络药理结果表明，姜天麻差异性成分可以与TNF、MAOB、MAOA、ACE、ADORA2A、TRPV1、PTGS2、NOS2、MMP9、HTR2C、HTR2B、HTR2A、HTR1B、PIK3CA、PRKCG、PRKCA、VEGFA、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、OPRM1、OPRK1、OPRD1、ADORA1、IKBKB、5-HTR1A、5-HTR1等相关靶点结合，通过Ca2+和cAMP信号通路、花生四烯酸代谢等多个通路作用，抑制炎症因子和神经递质的产生、减轻血管炎症、减少脑损伤和降低血脑屏障通透性，达到整体治疗偏头痛的目的。