液氮冻结软壳青蟹在冻藏期间的营养物质变化

郭丽萍 张丽敏 母昌考 叶央芳 王春琳

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

水产品因营养丰富和含水率高而高度易腐变质，直接影响消费需求和产品货架期。防止水产品腐败，维持其新鲜度是水产品质量安全的重要保障[1-2]。软壳蟹是我国沿海重要的水产品，经蟹类蜕壳后形成，具有肉质细嫩、味道鲜美、方便食用和高钙低脂等特性[3]。在我国，拟穴青蟹(Scylla paramamosain)常被加工成软壳蟹，软壳蟹除少部分用于鲜食外，大部分被冷冻保藏。低温冷冻是保藏水产品的一种常用方法，但低温下仍有腐败菌和酶类的作用，导致水产品在冷藏过程中腐败变质[4]。冻结保鲜是将拟冻藏的水产品中心温度降低到冰点以下的一种保鲜技术[5-6]。液氮(liquid nitrogen，LN)冻结是一种常用的食品冻结保鲜技术[7-8]，已被成功应用于三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[9]、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[10-11]和鳙鱼糜[12]的冷冻保藏，能显著提高水产品在冻藏期间的品质，有效减缓挥发性盐基氮和菌落总数的增加，维持肌肉组织的质构特性，防止蛋白质变性。因此，LN 冻结可能是一种延长软壳蟹冻藏期的有效方法。

目前，水产品的质量和新鲜度评价已不再局限于主观的感官评价和片面的物质分析，而倾向于与质量相关物质的全局定性和定量分析[13]。其中，基于高分辨核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)的代谢组学技术是食品质量评价的有力方法，被广泛应用于食品研究领域[14-15]，不仅能揭示代谢图谱与食品质量之间的相关性[16-17]，还能揭示食品质量指标[18-19]。在蟹类质量研究中，基于NMR 的代谢组学技术已应用于鉴别蓝蟹(Callinectes sapidus)与石蟹(Eriphia verrucosa)和黄道蟹(Cancer pagurus)的代谢物组成差异[20]，以及检测三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发酵过程中小分子营养物质的组成变化[21]。因此，基于NMR 的代谢组学技术有助于了解LN 冻结对软壳蟹在冻藏过程中的代谢谱变化，进而了解软壳蟹的质量状况。

本研究以拟穴青蟹软壳蟹为材料，采用基于NMR的代谢组学技术评估LN 冻结对短期冻藏软壳蟹肌肉和肝胰腺代谢谱的影响，并考察LN 冻结软壳蟹在长期冻藏期间肌肉和肝胰腺代谢谱的变化，以期为软壳蟹冻藏技术及其品质评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活的拟穴青蟹硬壳蟹购自浙江宁波水产品批发市场，为获得数量足够的软壳蟹，购买80 只雄性硬壳蟹，每只蟹重约250 g，分别单养在配备有循环水的蟹公寓中，盐度控制在20‰～25‰。

甲醇、二水合磷酸二氢钠和三水合磷酸氢二钾(分析纯)，上海国药集团化学试剂有限公司；2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸钠[sodium 3-trimethylsilyl (2，2，3，3-d4) propionate，TSP]和重水(99.9%氘代)(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 主要仪器与设备

Bruker Avance Ⅲ600 MHz 核磁共振谱仪，德国Bruker 公司；5415R 低温高速离心机，德国Eppendorf公司；TD-XBYM 组织破碎仪，北京同德创业科技有限公司；FreeZone 冷冻干燥机，美国Labconco 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 软壳蟹的LN 冻结和冻藏处理 密切观察拟穴青蟹蜕壳情况，选9 只刚蜕壳的青蟹作为新鲜软壳蟹对照组(CK0)，把软壳蟹置于冰水中麻醉3 min 后用于取样。将18 只刚蜕壳的软壳蟹在冰水中麻醉3 min，随机选取9 只软壳蟹直接单独真空包装，在-20℃条件下短期冻藏7 d，作为冻藏对照组(CK7)。余下9 只软壳蟹经液氮(-196℃)冷冻3 min 后，分别单独真空包装，再置于-20℃冻藏7 d，作为LN 冻结组(LN)。再收集40 只刚蜕壳的软壳蟹，置于冰水中麻醉3 min 后，用液氮速冻3 min，然后分别单独真空包装。把包装后的软壳蟹平均分成5 组，每组8 只。分别于-20℃冻藏0、2、4、6 和8 个月取肌肉(分别设为M1、M2、M3、M4 和M5 组)和肝胰腺(分别设为H1、H2、H3、H4 和H5 组)样品用于NMR 分析。

1.3.2 软壳蟹肌肉和肝胰腺组织的营养物质提取 所有冻藏软壳蟹取样后在常温下自然解冻，称取各软壳蟹样品的肌肉和肝胰腺组织各0.5 g 用于小分子营养物质提取，参考Chen 等[22]的提取方法。

1.4 NMR 分析

一维1H NMR 谱和二维NMR 谱的采集均在298 K下用核磁共振谱仪采集，试验参数设置参见裴峰等[23]和娄永江等[24]的研究。

1.5 NMR 数据的多变量统计分析

在对样品的1H NMR 谱进行分段积分时，选取所有样品的谱区间为δ 9.20 ～0.80，并去除δ 5.2 ～4.8和δ 3.4～3.3 的信号区间以消除水和甲醇信号的干扰。再对每个积分区间的数据进行归一化处理，并利用SIMCA-P＋软件(V12.0，瑞典Umetrics 公司)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal projection to latent structure discriminant analysis，OPLS-DA)对归一化的NMR 数据进行多变量数据分析，方法描述参见裴峰等[23]的研究。但由于本研究样品重复数是9，因此，采用了8 倍交叉验证和交叉验证的方差分析(cross validation one-way analysis of variance，CV-ANOVA)[25]以评价OPLS-DA 模型的可靠性。同时采用回溯转换方法[26]处理自动规格化的NMR 数据，用于构建相关系数图。根据本研究样品的重复数，确定某物质对两组样品区分具有显著贡献的相关系数(r)的截断值为±0.632，即某一营养物质的｜r｜＞0.632 时，该物质对组间区分具有显著贡献(P＜0.05)。

为获得由LN 冻结和冻藏所导致的软壳蟹营养物质组成的差异，本研究计算了部分代谢物含量相对于对照的变化量，计算公式如下:(Cm-C0)/C0，其中，Cm表示营养物质在CK7、LN 或不同冻藏期软壳蟹肌肉(M2、M3、M4 和M5)或肝胰腺(H2、H3、H4 和H5)中的浓度，而C0分别表示营养物质在CK0 或冻藏对照组肌肉(M1)或肝胰腺(H1)中的浓度。

2 结果与分析

2.1 软壳蟹肌肉和肝胰腺提取物的NMR 分析

本研究共检测了134 个样品的一维1H NMR 谱，图1 显示了其中4 个典型的1H NMR 谱。根据同核和异核二维NMR 谱所提示的氢-氢之间和氢-碳之间的耦合关系，并参考文献[21]的信息，共归属到34 种小分子有机物，包括15 种氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、5 种核苷类物质[肌苷、尿苷、尿苷三磷酸、腺苷单磷酸(adenosine monophosphate，AMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)]、4 种有机羧酸(乳酸、琥珀酸、牛磺酸和延胡索酸)、3 种糖类(葡萄糖、海藻糖和麦芽糖)、2 种有机胺 类(组胺和二甲胺)、三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide，TMAO)、2 种有机碱类(甜菜碱和葫芦巴碱)以及2-吡啶甲醇和一种未知物质U1，详细的核磁信息见表1。尽管这两种组织的小分子物质相似，但各组织含有特定的代谢物。如肌肉含有较丰富的腺苷单磷酸AMP 和ATP，而肝胰腺中的含量则低于NMR 检测限。反之，肝胰腺含有较丰富的色氨酸、尿苷和尿苷三磷酸，而肌肉中的含量则低于检测限。

图1 软壳蟹肌肉和肝胰腺提取物的代表性1H NMR 谱Fig.1 Representative1H NMR spectra of the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

表1 软壳蟹肌肉和肝胰腺提取物中的1H 和13C NMR 数据以及代谢物归属Table 1 1H and 13C NMR data and assignments of the metabolites in the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

表1(续)

2.2 LN 冻结对短期冻藏软壳蟹肌肉和肝胰腺小分子营养物质组成的影响

为揭示LN 冻结对冻藏软壳蟹可能具有的保鲜作用，本研究首先采用主成分分析(principal component analysis，PCA)比较了LN 冻结对短期冻藏软壳蟹肌肉和肝胰腺NMR 代谢谱的影响，发现第一和第二主成分(PC1 和PC2)构建的PCA 得分图上，软壳蟹肌肉和肝胰腺在这3 组(CK0、CK7 和LN)之间均无明显区分(数据未列出)，表明冻藏和LN 冻结均未导致软壳蟹代谢谱发生明显变化，均具有较好的保鲜效果。但单变量分析显示，CK7 和LN 组中仍有个别代谢物相对于CK0 产生了较大变化(图2)，如肌肉中的二甲胺(dimethylamine，DMA)。CK7 肌肉的DMA 含量比CK0提高了2 倍；而经LN 冻结的软壳蟹，7 d 冻藏后肌肉的DMA 含量与CK0 持平。与DMA 的变化类似，CK7组肝胰腺的肌苷含量比CK0 提高了1 倍；而经LN 冻结的软壳蟹，7 d 冻藏后肝胰腺的肌苷含量仍维持CK0水平。除DMA 和肌苷外，其他小分子营养物质的变化大多在20%以下，仅肌肉中个别代谢物如缬氨酸、异亮氨酸和肌苷水平减少了30%～60%。

图2 LN 冻结短期冻藏软壳蟹肌肉和肝胰腺营养物质变化Fig.2 Relative changes of nutrients of soft-shell crab muscle and hepatopancreas after 7 d-frozen storage due to LN freezing

2.3 LN 冻结软壳蟹在长期冻藏期间的营养物质组成变化

为进一步揭示LN 冻结对软壳蟹长期冻藏的保鲜效果，本研究对不同冻藏期LN 冻结软壳蟹可食组织提取物的NMR 数据进行了PCA 分析。结果显示，组织差异是导致软壳蟹样品在PC1 和PC2 区分的主要原因，并在PC1 上发生了明显区分；而冻藏时间是导致样品区分的次要原因，其中肌肉样品在PC1 上有随冻藏时间变化的趋势，而肝胰腺样品的变化主要发生在PC2 上，且各组之间的区分不明显。表明冻藏对肌肉营养物质组成产生了较大影响，但对肝胰腺的影响较小(图3)。

图3 长期冻藏过程中软壳蟹肌肉和肝胰腺提取物的PCA 得分图Fig.3 PCA scores plots of the extracts of muscle and hepatopancreas of soft shell crabs during long term frozen storage

为详细了解冻藏过程中软壳蟹肌肉和肝胰腺组织的物质组成变化，对不同冻藏期组织样品的NMR 数据与冻藏前对照样品进行了两两比较的OPLS-DA 分析，共构建了8 个OPLS-DA 模型，其中7 个模型具有较高的Q2值，且经CV-ANOVA 分析得到的P值小于0.05(图4、5)，说明这7 个模型是具有可靠性的。由图4 可知，与冻藏前的软壳蟹肌肉相比，冻藏2 个月可导致肌肉中延胡索酸、ATP 和葫芦巴碱水平显著下降；冻藏4 个月可导致肌肉中甜菜碱、葡萄糖、麦芽糖和肌苷水平显著升高，而甘氨酸、延胡索酸和ATP 水平显著下降；冻藏6 个月可导致肌肉中甜菜碱、甘氨酸、葡萄糖、麦芽糖和肌苷水平显著升高，而ATP 水平显著下降；冻藏8 个月可导致肌肉中甜菜碱、葡萄糖、麦芽糖和肌苷水平显著升高，而甘氨酸和ATP 水平显著下降。冻藏对肝胰腺物质的影响较小，冻藏2 个月并未引起肝胰腺物质的显著变化，但之后的冻藏时间均导致酪氨酸、肌苷和尿嘧啶水平显著升高，而丙氨酸水平显著下降。除此之外，冻藏4 个月导致肝胰腺中谷氨酰胺和苯丙氨酸水平显著升高，冻藏6 个月还导致肝胰腺中谷氨酰胺和甘氨酸水平显著升高，冻藏8个月导致肝胰腺中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸水平显著升高(图5)。上述与冻藏显著相关的肌肉和肝胰腺代谢物的相关系数见表2。

图4 长期冻藏过程中软壳蟹肌肉提取物的OPLS-DA 得分图(A-D)和相关系数图(A’-D’)Fig.4 OPLS-DA scores plots (A-D) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A’-D’) generated by comparisons between the spectra obtained from extracts of muscle of soft-shell crabs during long term frozen storage

图5 长期冻藏过程中软壳蟹肝胰腺提取物的OPLS-DA 得分图(A-C)和相关系数图(A’-C’)Fig.5 OPLS-DA scores plots (A-C) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A’-C’) generated by comparisons between the spectra obtained from extracts of hepatopancreas of soft-shell crabs during long term frozen storage

为了解软壳蟹组织小分子营养物质随冻藏时间的变化，本研究采用单变量统计方法分析了部分代谢物水平相对于对照的变化。结果表明，在长期冻藏条件下，软壳蟹肌肉中变化最大的物质是肌苷，肌苷水平随着冻藏时间的延长而持续增加，至冻藏8 个月时肌苷水平已经比对照(M1)增加了4.6 倍(图6)。其次是麦芽糖和葡萄糖，这两种糖的水平也随着冻藏时间延长持续升高，至冻藏8 个月时分别比对照(M1)增加了4.4 和2.5 倍。而其他肌肉代谢物的变化均小于1倍。与软壳蟹肌肉组织类似，肝胰腺的肌苷水平变化最大，随着冻藏时间延长持续升高，至冻藏8 个月时比对照(H1)增加了3.6 倍。其次是谷氨酰胺和尿苷水平在不同冻藏期内产生了波动，最高水平分别出现在冻藏2 个月(1.7 倍)和冻藏4 个月(1.6 倍)时。其他肝胰腺代谢物的变化均较小。

3 讨论

本研究采用基于NMR 的代谢组学技术共检出软壳蟹可食组织中的34 种代谢物，这些物质大部分已在三疣梭子蟹[23]和拟穴青蟹[27]中被发现，个别物质如尿苷不常被NMR 检测到，可能与尿苷浓度较低有关。这些检出的代谢物是软壳蟹组织中的高丰度物质，对软壳蟹质量和风味具有重要作用。

尽管-20℃冻藏和LN 冻结均对短期冻藏的软壳蟹代谢谱无显著影响，但-20℃冻藏仍导致软壳蟹肌肉中DMA 和肝胰腺中肌苷水平的倍增，而LN 冻结可抑制这两种物质的增加。尽管DMA 不如鱼类腐败指标三甲胺(trimethylamine，TMA)[28]一样被广泛使用，但DMA 连同TMA 和氨气是腐败鱼类特征性腥味的主要组成，也是鱼类肉质新鲜度指标——总挥发性盐基氮的重要组成[29]。此外，DMA 也可作为鱼类风味和肉类质地的间接评价指标[30]。这是因为在TMAO 分解形成DMA 的过程中，可形成等摩尔量甲醛。甲醛可导致蛋白质交联，从而使鱼肉变硬。因此，冻藏软壳蟹肌肉中DMA 水平的升高不仅可以说明蟹肉新鲜度的下降，而且可以用来指示蟹肉质地的下降。但LN冻结抑制了冻藏软壳蟹肌肉中DMA 水平的升高，表明LN 冻结能较好地维持短期冻藏软壳蟹肌肉的新鲜度和质地。此外，已有研究表明，冻藏条件下的DMA通过非酶途径产生，即DMA 是由细菌分解产生[31]，本研究中冻藏软壳蟹肌肉中DMA 含量的升高是否与细菌活动有关值得进一步研究。

表2 软壳蟹肌肉和肝胰腺提取物中显著变化的代谢物的相关系数Table 2 The correlation coefficients of significantly altered metabolites in the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

肌苷是ATP 水解产物之一[32]。在鱼类死亡后，ATP 被依次降解为腺苷二磷酸、AMP 和肌苷单磷酸(inosine monophosphate，IMP)。ATP 降解为IMP 是一个快速自溶的过程，但IMP 继续被降解为肌苷和次黄嘌呤相对缓慢，而且伴随着自溶和微生物活动[33]。因此，肌苷含量的升高与自溶变质和细菌腐败都有关系，可作为鱼冷藏过程中新鲜度的指标[34]，也作为鱼类新鲜度评价的另一个重要指标——K 值的重要贡献因子[35]。此外，肌苷具有苦味[36]，因此，冻藏软壳蟹肝胰腺中肌苷水平的升高可能指示着肝胰腺新鲜度的下降和苦味的增加。但LN 冻结可抑制冻藏软壳蟹肝胰腺肌苷水平的升高，表明LN 冻结能较好地维持短期冻藏软壳蟹肝胰腺的新鲜度和口感。尽管本研究只采用短期冻藏来评价LN 冻结对软壳蟹质量的影响，可能更长时间的冻藏更能显示LN 冻结的效果，但7 d 冻藏时间已经显示LN 冻结对软壳蟹在冻藏过程中新鲜度和口感下降的减缓效应。

图6 长期冻藏过程中软壳蟹营养物质的变化Fig.6 Relative changes for muscle and hepatopancreas nutrients in the soft shell crabs during long term frozen storage

LN 冻结虽然在软壳蟹短期冻藏中发挥了较好的保鲜效果，但在长期冻藏中，软壳蟹的小分子营养物质仍然发生了显著变化。这些变化主要发生在肌肉的肌苷、麦芽糖和葡萄糖以及肝胰腺的肌苷、谷氨酰胺和尿苷的升高。特别是肌苷在8 个月的冻藏过程中增加了3～5 倍，但这个增速相对于未用LN 冻结的软壳蟹来说相对减缓，因为冻藏7 d 的软壳蟹肝胰腺中肌苷升高了1 倍，尽管相应肌肉组织中的肌苷变化较小。由于肌苷水平的增加指示着软壳蟹新鲜度的下降和苦味的增加，因此长期冻藏会对软壳蟹的新鲜度和风味产生影响。但值得关注的是，经LN 冻结的软壳蟹中DMA 水平在8 个月冻藏期间均未显著升高，表明LN冻结仍然起到了减缓软壳蟹腐败的作用。而其他物质如肌肉中麦芽糖和葡萄糖以及肝胰腺中谷氨酰胺的升高，显然有助于软壳蟹肌肉具有更高的甜味和肝胰腺具有更好的鲜味[36]。此外，其他营养物质如肌肉中的ATP、延胡索酸和甜菜碱等以及肝胰腺中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和尿嘧啶等在软壳蟹冻藏过程中发生了明显波动，这些物质属于核苷类、有机羧酸、有机酸和有机碱类，必然导致软壳蟹风味的变化，同时也影响软壳蟹的质量。但这些物质在冻藏前后的水平变化较小，因此，可能对软壳蟹风味和质量的影响相对有限。总之，LN 冻结处理的软壳蟹虽然在冻藏8 个月期间发生了小分子营养物质的明显波动，但除肌苷的升高可能对软壳蟹的新鲜度有不利影响外，其他物质的变化影响可能较小，甚至具有积极影响。

4 结论

本研究在软壳蟹肌肉和肝胰腺中共检出34 种代谢产物，其中大部分是氨基酸。-20℃冻藏和LN 冻结均对短期冻藏的软壳蟹代谢谱无显著影响，但-20℃冻藏仍导致肌肉的二甲胺和肝胰腺的肌苷水平倍增，而LN 冻结能抑制这两种物质的增加。而长期冻藏可导致LN 冻结软壳蟹肌肉的肌苷、麦芽糖和葡萄糖以及肝胰腺的肌苷、谷氨酰胺和尿苷水平显著升高。表明LN 冻结可有效缓解长期冻藏软壳蟹的质量下降。本研究为LN 冻结在软壳蟹冻藏中的应用提供了方法参考。