OsTZF9基因过量表达调控水稻多种生长发育表型

周淑芬 刘宝 张迪

摘 要：RRTZF基因在植物的生长发育和逆境胁迫中起着重要作用。OsTZF9基因是水稻RRTZF基因家族的一员，为分析OsTZF9基因的生物学功能，构建了由Ubiqutin启动子驱动的植物过表达载体pCXUN-TZF9，通过农杆菌介导法获得了转基因再生植株6个克隆。进一步分析转基因植株后代的表型发现，与野生型日本晴相比，OsTZF9基因过表达植株的株高、分糵数、有效穗数、穗长和千粒重均下降;与转基因阴性分离株相比，OsTZF9基因过表达植株抽穗期推迟。

关键词：水稻;OsTZF9基因;过量表达;表型分析

中图分类号：S 511   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）11-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.001

Overexpression of OsTZF9 Gene Regulates Various Phenotypesof Growth and Development in Rice

ZHOU Shu-fen1，2， LIU Bao1，2， ZHANG Di1，2

（1. Institute of Biological Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China;

2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Genetic Engineering， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： RR-TZF gene plays an important role in plant growth， development and stress responses. OsTZF9 gene is a member of rice RR-TZF gene family. In order to analyze the biological function of OsTZF9 gene， a plant overexpression vector pCXUN-TZF9 driven by Ubiqutin promoter was constructed， and 6 clones of transgenic regenerated plants were obtained by using the agrobacterium-mediated method. Further analysis of the phenotype of the progenies of the transgenic plants showed that plant height， tiller number， effective panicle number， panicle length and 1000-grain weight of the OsTZF9-overexpressed plants were decreased compared with those of the wild-type Nipponbare; compared with the transgenic negative isolated plants， heading date of the OsTZF9-overexpressed plants was delayed.

Key words：Rice; OsTZF9 gene; Overexpression; Phenotypic analysis

RRTZF基因是一类植物特有的CCCH型锌指基因，因其编码蛋白含有1个TZF模体及其上游50个氨基酸为富含精氨酸区（RR）而得名。不同于保守的TZF模体（CX8CX5CX3HX18CX8CX5CX3H），RRTZF蛋白中的TZF模体是由中间间隔16个氨基酸的两个不同CCCH结构域组成[1-2]。通过全基因组学分析，目前已在多种植物中鉴定了许多RRTZF成员，如在拟南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、苜蓿和杨树中分别鉴定了11、9、12、6、22、5和16个RRTZF基因，它们受多种发育阶段和环境信号的影响，在植物中的表达模式呈多样化[3]。

除了拟南芥中所有RRTZF基因的功能得到一定程度的解析，其他植物中仅有少数RRTZF基因的功能获得研究。水稻中，仅有OsTZF1和OsTZF2（OsDOS）两个复制基因的功能研究较为深入。OsTZF1正向调节ABA反应、负向调节PHYB和PHYC介导的红光与远红光反应、参与盐胁迫反应及JA诱导的叶片衰老[4];OsTZF2（OsDOS）通过JA诱导途径负向调控水稻叶片衰老[5]。通过前期研究发现OsTZF9基因在水稻的胚乳中特异性表达[6-7]，为了进一步了解OsTZF9基因的功能，本研究构建了OsTZF9基因过表达载体，获得了过表达转基因植株并进行系统的田间表型调查。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因受体材料为粳稻Oryza sativa L.ssp.Japonica日本晴Nipponbare。

大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404、质粒pCXUN和pCXUNTZF9，均由福建省農业遗传工程重点实验室保存。pCXUN为植物过表达骨架载体， TDNA区包含携带由35S启动子驱动的潮霉素B磷酸转移酶基因及Ubiquitin启动子（用于启动目的基因），pCXUNTZF9为OsTZF9基因过表达载体。

1.2 载体构建

以日本晴基因组DNA为模板，用高保真酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）PCR扩增OsTZF9基因全长，并用普通Taq酶进行加A处理。所用的PCR引物为OsTZF9F：5′CAAAGCACATTGCAAACACAG 3′和OsTZF9R：5′GTAACACACCCATCTACACGAAG3′。

用Xcm I 酶切pCXUN质粒，获得3′末端突出1个T碱基的线性骨架载体，通过TA克隆法与上述OsTZF9基因全长PCR产物连接，挑单克隆测序获得连接正确的OsTZF9基因植物过表达载体，并通过电激法转化农杆菌LBA4404，于-80℃下保存备用。

1.3 农杆菌介导的水稻遗传转化

以日本晴成熟胚诱导的愈伤组织为农杆菌侵染材料，经过抗性愈伤组织的筛选、分化及生根获得再生水稻植株，相关的培养基及试验步骤参照文献[8]。

1.4 转基因植株的检测

叶片浸泡潮霉素方法筛选转基因植株：田间采取新鲜分蘖期待检测水稻植株叶片，浸泡于50 mg·L-1的潮霉素溶液中，28℃光照培养3～5 d后统计水稻对潮霉素的抗感情况，叶片无褐斑为抗，即为转基因植株;叶片出现褐斑为感，即为非转基因植株。

PCR扩增方法筛选转基因植株：以CTAB法[9]提取的水稻叶片基因组总DNA为模板，用引物TZF9T1：5′TAGCCCTGCCTTCATACGC 3′和TZF9T2：5′TTGGTCGGGTCAATGGTTA  3′进行PCR扩增。扩增片段247 bp，包括Ubiquitin启动子和目的基因区域的DNA片段。PCR扩增程序为：94℃，预变性5 min;{94℃，45 s;56℃，45 s;72℃，45 s}，35个循环;72℃，延伸8 min。

1.5 田间种植

选取OsTZF9基因过表达株系3个克隆（OT9-3、OT9-20和OT9-40）、野生型日本晴及转基因阴性分离株进行田间种植，每份材料种植成一个小区，每个小区种植6行，每行栽7株苗，种植密度为20 cm×20 cm。

1.6 主要农艺性状调查

株高、分蘖数、有效穗数、穗长和结实率的调查：成熟后每个小区随机选取非边行的5～10个具有代表性的单株进行分析，以它们的平均值作为每个株系的农艺性状表现值。每株有效穗数统计标准为结实籽粒大于或等于5粒的所有稻穗，測量所有有效穗穗长的平均值为该株的穗长，所有有效穗的结实率为该单株的结实率。

抽穗期调查：水稻抽穗时，每2 d调查1次各个小区中每个单株的始穗期，以每株主穗抽出1 cm作为该株始穗的标准，以从播种到始穗的天数为抽穗期。

粒重称量：每个小区选取6个具有代表性的单株，脱粒后于烘箱中烘干至恒重，每个单株饱满种子重量除以各自种子粒数，然后再乘以1000即获得每个单株千粒重，6个单株千粒重的平均值即为该株系的粒重。

1.7 统计分析

利用SPSS软件进行单因素方差分析，并用邓肯方法进行多重比较。结实率先通过反正弦化后再进行分析。

2 结果与分析

2.1 OsTZF9基因过表达载体的构建

以日本晴基因组DNA为模板，用高保真酶PCR扩增获得了以日本晴为背景的OsTZF9基因全长PCR产物， PCR产物胶回收后用普通Taq酶加A尾巴，通过TA克隆方法与pCXUN线性载体连接，经测序获得了正向连接且序列正确的植物过表达载体，命名为pCXUNTZF9（图1）。通过电激法导入农杆菌感受态细胞LBA4404，挑取单克隆进行菌液PCR，获得了能扩出目的片段的阳性单克隆并保存于-80℃备用。

2.2 过表达转基因植株的获得

利用农杆菌介导转化法，将pCXUN-TZF9载体导入日本晴成熟胚诱导的愈伤组织中，共获得了再生转化植株50个克隆，每个克隆各选取2个单株共100个单株种植于大棚中。对各个单株进行叶片潮霉素抗感性试验，结果显示：50个克隆100个单株中共有20个克隆39个单株（其中1个克隆只检测到1个单株具有潮霉素抗性）具有潮霉素抗性。

进一步对具有潮霉素抗性的39个单株叶片基因组DNA进行PCR，结果发现，仅6个克隆12个单株能扩出明亮的目的条带（图2）。对具有明亮条带的PCR产物进行测序，结果均为预期的目的序列。以上结果表明了OsTZF9基因过量表达载体的TDNA区成功地插入到水稻基因组中。

2.3 OsTZF9基因过量表达对水稻主要农艺性状的影响

系统调查OsTZF9基因过表达株系的田间农艺性状表现，结果显示，在分析的5个性状中，除结实率外，3个不同转基因克隆的过表达株系的其他4个性状均与野生型日本晴（CK）存在显著差异（表1）。过表达株系的平均株高为52.2～61.0 cm，比对照低8.0～16.8 cm;平均分蘖数为12.9～14.2个，比对照减少5.2～6.5个;平均有效穗数为10.8～14.1个，比对照减少4.0～7.3个;平均穗长为12.0～13.4 cm，比对照减少2.1～3.5 cm。可见，OsTZF9基因过量表达对水稻的株高、分蘖数、有效穗数和穗长具有抑制作用。

2.4 OsTZF9基因过表达对水稻粒重的影响

选取3个不同克隆的OsTZF9基因过表达T2代纯合株系种植于田间中，对成熟期收获的不同株系的种子进行千粒重称量发现，OsTZF9基因过表达株系的平均千粒重15.5～21.5 g，均显著低于野生型日本晴（CK）（23.3 g），其中OT920株系的千粒重最小，比对照减少7.8 g（图3）。对上述3个克隆OsTZF9

基因过量表达株系继续种植T3代，粒重分析结果显示T3代的平均千粒重均明显低于对照（图4），说明了OsTZF9基因过量表达降低水稻粒重具有遗传稳定性。

2.5 OsTZF9基因过量表达对水稻开花的影响

前期田间性状调查时发现OsTZF9基因过表达植株具有推迟水稻开花的现象，进一步选取3个不同克隆的OsTZF9基因过表达T1代植株进行抽穗期调查，同时以转基因植株后代阴性分离株为对照，结果显示OsTZF9基因过表达植株的平均抽穗期为68～85 d，比对照推迟14～31 d（图5）。继续跟踪调查OsTZF9基因过表达T2代植株抽穗期发现，3个不同克隆OsTZF9基因过表达植株的抽穗期均比阴性分离株长（图6）。以上结果，说明了OsTZF9基因过量表达具有推迟水稻开花的作用。

3 讨论与结论

植物RRTZF蛋白是植物生长发育及胁迫反应的一个潜在调节因子。拟南芥中， AtTZF2和AtTZF3基因过表达植株对ABA超敏感和耐旱性[10]，种子特异表达基因AtTZF4、AtTZF5和 AtTZF6是ABA、GA和光敏色素B（phyB）介导的种子萌发的负调控因子[11]。Chen等[12]研究发现，水稻中OsTZF9蛋白与谷蛋白基因GluB1启动子区结合，OsTZF9基因RNAi植株种子中的总氮含量比对照高。本研究发现，OsTZF9基因过表达植株的千粒重下降。这些结果暗示了OsTZF9基因是一个水稻粒重和种子蛋白质含量的负调控因子。

拟南芥RRTZF基因过量表达研究发现，不同RRTZF基因过表达植株具有一因多效的现象，且存在着一些相似表型[13]。如AtTZF1基因过表达[14]时，具有AtTZF11和AtTZF10基因过表达植株的抗寒和抗旱性，同时还具有AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因过表达植株种子萌发推迟的现象;AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因在拟南芥中组成型表达[11]时，出现了一系列和AtTZF1基因过表达类似胁迫耐受表型。水稻中，OsTZF1 和OsTZF2基因过表达植株均表现多种表型[4-5]，而且它们均具有推迟水稻叶片衰老的现象。本研究也发现，水稻胚乳强优势表达OsTZF9基因组成型过表达时具有降低株高、分蘖数、有效穗数、穗长和粒重及推迟抽穗等多效表型，它与OsTZF2基因过表达植株均具有推迟水稻抽穗的现象。这些结果表明了植物RRTZF基因的功能可能具有一定的冗余现象，同时也暗示了它们可能通过一个保守的基本分子机制起着类似的作用。

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（責任编辑：柯文辉）