女性生殖道微生物群与不孕症的相关性研究进展

王晓丽，杨晓葵

人体体表、体腔内存在的大量非致病微生物群与人类宿主共同构成了“共生总体”，协同进化，互利共生，这些微生物参与人体多种生物学过程，在人类的生存和进化中发挥重大作用，如对抗病原体、促进免疫系统成熟、参与代谢及合成维生素、调节生殖健康、影响子代健康等[1]。女性生殖道是一个开放系统，除阴道附着大量常住菌外，上生殖道也定植着多样而低丰度的菌群[2]。这些常住共生菌与生殖道黏膜一起构成了生殖道的第一道免疫防线[3]。微生物群失调可导致免疫屏障破坏，局部生理功能改变，引发胚胎着床失败、流产及各种孕期并发症，进而影响生殖结局[4]。本文回顾了近期国内外关于女性生殖道各部位微生物群的组成和影响因素以及生殖道微生物群失调与不孕症相关性的研究进展，尤其关注生殖道菌群对辅助生殖技术的影响，并简述人类宿主免疫系统与微生物的相互作用及女性生殖道微生物群未来的研究方向。

1 微生物群概述

微生物群也称为微生物区系，指包括细菌、病毒、真菌等共生总体中所有微生物的集合，参与机体的免疫、生物屏障等多种生理功能[1]。

随着现代技术的飞速发展，人类对微生物群的了解不断深入，传统的微生物检测方法(包括光学显微镜及培养法)已不能满足对微生物群的研究。基因组测序技术的出现和持续发展为全面了解和研究微生物群提供了有力的支撑，目前已经建立的检测平台包括16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)测序、全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)、IS-pro(intergenic spaces-pro)技术及实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术等。其中，16S rRNA测序技术为二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)，以进化树的形式分析微生物群落结构[4]，目前应用最为广泛。

2 女性生殖道微生物群及影响因素

2.1 阴道微生物群

阴道常住菌有乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、棒状杆菌、链球菌等，其中乳杆菌为优势菌，通常占90%以上[5]，载菌量达107～109/g分泌物[2]。

乳杆菌通过多种机制保护阴道内环境稳定。首先，产生乳酸，形成阴道内酸性环境，产生过氧化氢、细菌素、表面活性物质等，抑制其他细菌生长；其次，乳杆菌结合到阴道上皮表面，以机械屏障方式阻止其他细菌与上皮细胞结合；再者，乳杆菌及其产物还可激活机体的先天免疫系统成分对抗病原体[6-7]。

多种因素可以影响阴道菌群变化。其中，卵巢激素尤其是雌激素，对阴道菌群影响较大。育龄期女性以乳杆菌为主[2，5]，菌群的种类在月经期呈多样性，在排卵期及黄体中期最稳定[7]；绝经后因雌激素降低导致乳杆菌定植显著减少。此外，阴道菌群受到口服避孕药、宫内节育器、性伴侣数量、种族等多种因素影响[8]。

2.2 宫腔微生物群

传统观念认为宫腔无菌，新近研究证实宫腔内可能存在定植菌，且非病理性定植[9]。迄今为止，大多数研究报告宫腔菌群以乳杆菌为主[4, 10]，另有丰富的链球菌科及双歧杆菌科。在宫腔微生物群组成方面，不同研究结果并不一致。Chen C等[2]联合传统培养法及基因组测序技术检测到宫腔载菌量为阴道的万分之一，乳杆菌并非主要菌群，假单胞菌属、不动杆菌属等占据了较大构成比例，宫腔菌群种类呈高多样性和低生物量，轻度弱碱性。2018年，该团队采用WGS技术在宫腔内又发现了真核细胞、病毒、古细菌及噬菌体的存在[11]。关于宫腔微生物群研究的差异可能与机体处于不同的生理或病理状态有关。

宫腔微生物群与女性激素变化有关，在黄体中期较为稳定[10]，其组成在分泌期和增殖期有明显差异[2]，增殖期细菌繁殖多于分泌期，其随时间或月经周期改变的规律尚不明确。此外，宫腔菌群还受到阴道、腹腔菌群及妊娠的影响[12-13]。

2.3 输卵管微生物群

输卵管微生物群以假单胞菌属等为主要菌群，乳杆菌占比仅为1.6%[2]。另有研究发现乳杆菌未见于所有输卵管标本中，输卵管间质部、壶腹部菌群存在明显差异，双侧输卵管的菌群也不尽相同，这些可能与血管系统、盆腔解剖及腹膜液体静压有关[14]。

2.4 卵巢微生物群

在卵泡期及排卵期，由于自发性子宫收缩，阴道后穹隆的细菌可穿过宫颈及子宫，上达输卵管，甚至优势卵泡内[12]。有研究者在子宫肌瘤、子宫腺肌病及子宫内膜癌等患者的卵巢中发现了包括乳杆菌、棒状杆菌、布劳特氏菌等的微生物群，个体间差异较大，考虑与疾病状态有关[15]。目前尚无关于正常人卵巢或卵泡液微生物群组成及影响因素的研究报道。

3 微生物群异常与不孕

微生物群携带的微生物基因组同宿主基因组一样，可以稳定地从上一代传递至下一代，从而延续物种和共生总体的特性[16]。人体相关部位的微生物群之间存在着密切联系。女性生殖道微生物群在生殖的各个阶段均发挥重要作用，包括配子形成及运输、受精、妊娠的建立和维持，甚至是新生儿出生前在母体宫腔内菌群定植及在经阴道分娩过程中母体阴道菌群在新生儿肠道内定植[9]。当菌群失调时，通过炎症反应、免疫等机制导致不孕。

3.1 阴道微生物群失调

阴道菌群失调与不孕关系密切。细菌性阴道病(bacterial vaginosis, BV)的菌群特点是阴道菌群由正常的以乳杆菌为主变为各种细菌混杂，是最常见的阴道菌群失调。一项荟萃分析显示，不孕女性中BV发生率高达16.4%，其中输卵管性不孕者BV的发生率显著高于因其他原因不孕者[17]，可能与BV相关细菌上行进入上生殖道引起输卵管的亚临床感染及继发炎性损伤，继而引起配子运输障碍有关。另有研究发现，不孕女性中以多囊卵巢综合征患者及不明原因不孕患者BV发生率相对较高，分别为60.1%和37.4%，合并多囊卵巢综合征的不孕女性BV的发生可能与激素异常(尤其是游离雄激素增高)导致阴道菌群调控失衡有关，其妊娠率在BV治疗后明显增加，这表明在多囊卵巢综合征不排卵/稀发排卵导致不孕的基础上，BV可能进一步通过影响胚胎着床而导致不孕率增加[18]。在辅助生殖技术中，阴道菌群失调还与不良生殖结局有关，不同基因检测技术如16S rRNA测序[19]、IS-pro技术[20]均证实阴道微生物群以细菌种类少、乳杆菌属为主要菌群的女性更容易在体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)中成功妊娠。

3.2宫腔微生物群失调

宫腔菌群失调可引发持续性炎症过程如慢性子宫内膜炎(chronic endometritis, CE)，导致子宫内膜结构和功能被破坏，影响胚胎着床。不孕人群中CE发生率可高达56.8%，CE主要通过引起雌孕激素受体表达异常使子宫内膜蜕膜化受损、改变宫腔内环境细胞因子、使子宫内膜异常蠕动等机制，降低子宫内膜容受性，干扰胚胎着床[21]。Liu Y等[22]应用16S rRNA技术研究不孕女性宫腔液体中微生物群，发现CE组的乳杆菌丰度显著低于无CE组。应用抗生素治疗CE后，可改善自然受孕率及反复种植失败(recurrent implantation failure, RIF)胚胎着床率[21]。另一项评估抗生素对RIF患者CE疗效的荟萃分析表明，与持续CE组相比，经组织学确认已治愈CE组胚胎着床率及临床妊娠率明显增高[23]。

宫腔菌群失调还可通过降低子宫内膜对性激素反应性、糖蛋白分泌受损及胞饮突发育迟缓等机制影响胚胎着床[24]。对部分新鲜周期RIF的不孕女性采取冷冻胚胎移植可显著提高妊娠率[25]，说明这组人群的宫腔微生物可能对卵巢刺激造成的超生理水平的性激素很敏感，进而影响了胚胎着床。此外，宫腔菌群失调可能会激活胚胎发育过程中抗血管生成的信号通路，改变滋养层和内皮细胞功能，导致流产或产科并发症如子痫前期的发生[26]。

宫腔菌群失调还可能通过炎症反应使子宫异常收缩和经血逆流种植导致子宫内膜异位症而引起不孕和/或不良妊娠结局。“在位内膜决定论”指明了该疾病的本质在于宫腔在位内膜，患有子宫内膜异位症的低生育力女性的宫腔菌群确实存在明显异常，以功能为鞭毛组装及芳香氨基酸合成的细菌种类为主[2]，在子宫内膜异位症患者的宫腔及卵巢子宫内膜异位囊肿液中可以检测到显著增高的链球菌科、葡萄球菌科及肠杆菌科等[27]，进一步证实了生殖道微生物参与子宫内膜异位症的发病。

宫腔菌群对胚胎着床的意义大于阴道菌群。对比RIF及首次行IVF-ET患者的生殖道菌群，两者阴道菌群无差异；但两者宫腔菌群有明显差异，在RIF组宫腔中检测到独有的克伯氏菌[28]。宫腔菌群对自然妊娠预后也有提示意义，比较同一女性分别以孕8周自然流产(整倍体)和足月分娩为结局的前后两次妊娠的宫腔菌群结果，发现前次妊娠宫腔菌群以非乳杆菌为主；后次则以乳杆菌为主(乳杆菌占91%)，且主要为惰性乳杆菌。这进一步证实宫腔菌群的优势菌群及菌种类别可对妊娠结局产生重要影响[29]。

3.3 输卵管微生物群失调

输卵管性不孕主要病因是性传播疾病所引起的输卵管炎症，最常见的病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等，其血浆中相应抗体明显升高[30]。输卵管积液的不孕女性在切除输卵管后，其助孕结局明显改善，除了与去掉输卵管积液的胚胎毒性、机械冲刷、子宫内膜容受性受损等不良影响因素外，也可能与去除了输卵管的内源性致病微生物有关。由于取材受限等原因，尚无不孕女性输卵管微生物群组成的相关研究。

3.4 卵巢微生物群失调

卵巢微生物群的组成与不同疾病状态有关，可能在卵泡发育、多囊卵巢综合征、卵巢早衰等与不孕相关的疾病中发挥作用，还需进一步研究[15]。而卵泡液中定植的微生物群与辅助生殖技术密切相关，研究发现，双侧卵泡液内微生物群不同，其内固有的定植菌群会导致不良生殖结局，明显降低IVF成功率，而卵泡穿刺液中的乳杆菌有利于胚胎的成熟及移植[31]。

4 研究现状与展望

在人类宿主与共生微生物进化过程中，正常微生物群被视为先天免疫系统的一部分，与黏膜屏障一起保护机体，同时又在上皮细胞、粘液、免疫球蛋白A、抗菌肽以及免疫细胞的联合作用下与机体隔离[3, 16]。机体免疫细胞通过模式识别受体感知微生物的存在，建立宿主-微生物相互作用机制。

共生微生物群以生物屏障的模式，通过与病原体竞争营养和黏膜空间而发挥控制性防御作用，并维持微生物群内环境的稳定。当正常微生物群落的构成比例变化或外源性病原体侵入，即生殖道菌群紊乱时，活菌、死菌及死菌碎片或细菌产物均可能通过诱发不同的免疫应答而改变子宫内膜容受状态，进而影响胚胎着床、发育[32]。子宫内膜免疫系统非常独特，既要适应子宫内膜周期性脱落、生长变化，又可耐受同种半异体移植的胚胎(即使是赠卵的胚胎)，说明微生物群、免疫系统及胚胎之间存在着微妙的交互作用。微生物紊乱与免疫系统异常可能互为因果关系，导致不孕。

不同于阴道的微生物群，上生殖道定植着特有的微生物群，且微生物种类多而生物量低，与生育力、女性激素水平、免疫等密切相关，尤其是乳杆菌的种类和占比，对生殖结局起到决定性作用。虽然因检测技术、个体差异以及分别取不同组织做微生物检测不能代表全部菌群[33-34]等因素的限制，尚不能得出“女性生殖道核心微生物群”的定论，但生殖道微生物学研究为人类生殖医学的病理生理学基础提供了新思路。

女性生殖道常住微生物群处于时间与空间动态变化的微妙平衡中。评估生殖道微生物群为人类生殖、妊娠及新的生命体开创了新视角，对改善女性生殖健康具有重要意义。随着研究样本量的扩大，取材技术的改进，结合基因组学、转录组学、蛋白质组学、免疫组学及代谢组学新技术新理论，人类将描绘出健康生殖道微生物群落结构和层级，阐释生殖道微生物的重要功能及微生物与宿主之间微妙关系，及时识别菌群失调，调整和优化受孕时机，甚至靶向微生物干预，进一步改善人类健康和生育力。