噬菌体对奶牛乳房炎主要致病菌生物被膜防控的研究进展

宋军，阮红日 综述，武瑞 审校

黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省牛病防制重点实验室,黑龙江大庆163319

奶牛乳房炎(bovine mastitis)在世界范围内发病率很高,是奶牛养殖业最常见的疾病之一,也是危害奶牛生产最严重的一种疾病,会导致奶牛产奶量下降,牛奶品质降低,给奶牛养殖业带来巨大的损失［1］。因此,有效防治奶牛乳房炎是奶牛养殖业发展亟待解决的问题。有调查发现,临床彻底治愈奶牛乳房炎十分困难,总是反复发作,目前最有说服力的观点是乳腺组织内存在细菌生物被膜(biofilm,BF)结构,且已有报道证明,BF 是奶牛乳房炎重要的致病因素之一［2］。使用抗生素虽然可以减少生物被膜中的细菌数量,但并不能彻底根除生物被膜,因此,急需一种可有效防控细菌BF 的方法。

噬菌体是一种能感染细菌的病毒,是地球上最丰富的“生物物种”,因其特异性强、毒副作用小、来源广泛等特点被认为是抗生素的一种替代品［3］,目前已广泛应用于医学、水产、畜禽养殖等邻域。本文对噬菌体防控奶牛乳房炎的相关应用研究进展作一简要综述,并对噬菌体及其裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 的可行性进行分析,旨在为临床奶牛乳房炎的防治提供新的思路。

1 细菌BF 的生物学意义

BF 是指细菌黏附于物体表面,分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将其自身包绕其中而形成的膜样结构［4］。在自然界、工业和医学环境中,细菌主要以该种方式生存。有研究显示,与浮游形式相比,BF 内的细菌对抗生素的抵御能力提高了10 ～1 000倍［5］。且当膜内细菌达到一定密度时,就会触发一种机制来降解细胞外基质,使膜内细菌分散定植到其他位置,重新启动BF 的发育,进而增强细菌侵袭力［6］。

自 1987 年 COSTERTON 等［7］首次描述了 BF与疾病的关系后,BF 相关感染备受关注,目前已证实,表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(多种类型的医院感染)、大肠埃希菌(细菌性前列腺炎、胆道感染)和链球菌(龋齿、牙周炎、心内膜炎、脑膜炎、肺炎)等形成的BF 均可引起慢性感染［8］。而这其中的多种细菌也是奶牛乳房炎的主要致病菌,因此,奶牛乳房炎反复的问题很可能与病原菌形成BF 有关。

2 乳腺组织内形成BF 的危害

奶牛乳房炎是指因微生物感染或理化因素刺激所导致的炎症反应,是奶牛养殖业中危害最大、投入最多、防治最难的一种疾病。临床上奶牛乳房炎的治疗几乎均是根据药物敏感检测结果作为用药的参考指标,但治疗效果往往不理想,很多时候只是控制了临床症状,而乳房的健康状况未得到改善,停药后各种临床症状又纷纷表现出来。有研究发现,如第1次治疗不能彻底治愈,乳房炎的复发风险将会大大提高,这与乳腺组织内细菌BF 密切相关［9］。COSTA等［10］发现,临床常用于治疗奶牛乳房炎的沙星类药物在亚抑菌浓度促进了乳房炎大肠埃希菌分离株BF 的形成。因此,许多研究人员将奶牛乳房炎复发归因于这种耐药机制。此外,标准化药物敏感性检测通常是用浮游细菌进行测试,而未考虑BF 对抗菌药物的耐受性［11］,因此,目前的治疗方法往往无法彻底治愈奶牛乳房炎,还会导致奶牛乳房炎反复发作。GOMES 等［12］对多种细菌BF 与奶牛乳房炎的关系进行了较系统的概述,认为BF 会增强细菌耐药性和致病性,导致乳房炎反复发作,难以治愈,因此,有效防治细菌BF 对于治疗奶牛乳房炎至关重要。

3 噬菌体及裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF的可行性分析

噬菌体能够感染并裂解细菌细胞,根据噬菌体与宿主细胞之间的关系可将噬菌体分为裂解性噬菌体和溶源性噬菌体两类,目前用于控制BF 的主要是裂解性噬菌体。裂解性噬菌体在感染细菌后会在细胞内复制,然后在细胞裂解后释放子代噬菌体,继续感染其他细菌细胞,是一种可自我复制的抗菌生物制剂。噬菌体治疗奶牛乳房炎的疗效早已被证实,SHUKLA 等［13］应用裂解性噬菌体治疗了 12 头经抗菌药物治疗无效的奶牛乳房炎病牛,12 头奶牛中10 头痊愈,认为噬菌体疗法更加经济高效。在国内也有类似的实验研究,孙利利等［14］从污水中分离出一株噬菌体,该噬菌体在体外可快速降低细菌浓度,为了进一步评价噬菌体对奶牛乳房炎的治疗效果,通过乳头管注入患病乳区,结果显示,经过2 ～5次治疗,大部分患牛被治愈。此外还有研究显示,噬菌体不仅对耐药细菌保持着高度的裂解活性,对其产生的BF 也有着很好的抑制和清除效果［15］,因此,噬菌体疗法极有望成为防治奶牛乳房炎的替代或补充疗法。

3.1 噬菌体防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 与浮游细菌相比,BF 内的细菌更难清除,而噬菌体可通过裂解BF 内细菌,破坏BF 的稳定性,是一种较为理想的清除方法［16］。KELLY 等［17］发现,噬菌体 K与其产生的酶混合后,可呈时间依赖性的方式去除聚苯乙烯板表面的 BF；之后,ALVES 等［18］用噬菌体K 与噬菌体DRA88 的混合物处理葡萄球菌形成的BF,在37 ℃下处理48 h 可完全除去聚苯乙烯板表面成熟 BF 结构；以类似的方式,GUTIÉRREZ 等［19］和KHALIFA 等［15］在实验中用其他类型的噬菌体也清除了聚苯乙烯板表面成熟的BF。此外,MORRIS等［20］利用患者感染处分离的金黄色葡萄球菌在钛柱支架表面培养BF,用头孢唑林和噬菌体鸡尾酒分别处理,发现噬菌体鸡尾酒处理48 h 后,BF 厚度及面积明显减少,而头孢唑林处理48 h 后的BF 未见改变,表明噬菌体对细菌BF 可能有更好的防治效果。但噬菌体疗法的安全性常倍受质疑,KOEN 等［21］通过小鼠乳腺炎模型评估噬菌体在体内的治疗效果,结果表明,噬菌体疗法可安全有效地减少乳腺内细菌数量,证明了噬菌体疗法在体内的安全性,认为噬菌体是一种最具发展前景的抗生素替代品。GENG等［22］同样采用小鼠乳腺炎模型评估噬菌体在体内的治疗效果,结果与KOEN 等［21］的研究相似,认为噬菌体疗法是治疗奶牛乳腺炎安全有效的替代疗法之一。因此,噬菌体疗法在防控细菌BF 无论是安全性还是有效性方面均是可行的。

3.2 噬菌体裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF随着噬菌体研究的不断深入,部分研究者从对噬菌体的研究逐渐转变为研究噬菌体的有效成分,发现噬菌体产生的裂解酶能有效抑制细菌BF 的形成,并清除已形成的BF,还能穿透BF 裂解成膜细菌［23-25］。SINGH 等［26］通过实验证明,噬菌体内溶素Ply187可有效减少金黄色葡萄球菌BF 含量和浮游细菌的数量,且不会使细菌出现耐药性。ZHANG 等［27］应用噬菌体裂解酶LysGH15 清除多种不同葡萄球菌属BF,还证明了裂解酶LysGH15 对表皮葡萄球菌引起的菌血症小鼠模型具有很好的治疗效果,表明裂解酶LysGH15 具有治疗葡萄球菌感染相关感染的应用价值。FENTON 等［28］发现,利用噬菌体衍生肽酶(CHAPK)可中断金黄色葡萄球菌BF 的形成,并可在4 h 内完全消除金黄色葡萄球菌已形成的BF,证实CHAPK 具有预防和治疗金黄色葡萄球菌感染的潜力。LU 等［29］设计了一种T7 噬菌体编码的解聚酶,利用其裂解能力和酶活性显著提高了噬菌体清除细菌细胞以及BF 的效率。NANNA 等［30］研究发现,多糖解聚酶DA7 和细菌内溶素LysK 均是金黄色葡萄球菌的强效生物被膜清除药物,且两者联合使用时对生物被膜的清除具有协同作用。因此,噬菌体裂解酶不仅能够清除BF,还可抑制BF 形成,是防治BF 相关感染的重要工具。

3.3 联合其他抗菌药物防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 噬菌体及其裂解酶均有较强的BF 降解能力,能够清除附着在固体表面、介质表面形成的BF,当与抗生素或其他抗菌药物联合应用时,可加强对BF 的清除及抑制作用。CHAUDHRY 等［31］研究发现,噬菌体与多种抗生素,如头孢他啶、环丙沙星等具有协同清除BF 的效果,但与妥布霉素这类抑制蛋白质合成的抗生素之间的协同效果不明显。ZHANG等［32］通过激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察显示,噬菌体联合含氯消毒剂清除BF 的能力优于单独应用噬菌体或含氯消毒剂对BF 的清除,可较大程度地降低膜内细胞密度和活力。KAUR 等［33］在实验中发现,二价钴离子如CoSO4 和噬菌体联合使用能阻止细菌BF 的形成。因此,噬菌体制剂不仅可单独应用于防治细菌BF,还可与其他抗菌成分联合应用。

综上所述,噬菌体不仅对耐药浮游细菌保持着高度的裂解活性,还对BF 具有良好的抑制和降解作用,且在应用噬菌体制剂时,还能与其他抗菌剂如抗生素、含氯消毒剂、糖醇、铁拮抗分子等联合应用,增强对BF 的清除效果［34］。因此,与常规治疗方法相比,噬菌体在防控BF 方面更具有应用潜力。

4 噬菌体及裂解酶治疗的优缺点

细菌耐药性问题日益严重,目前已进入后抗生素时代,抗生素的治疗效果愈发不明显,寻找新的抗菌制剂刻不容缓。近些年,人们逐渐意识到利用噬菌体及裂解酶来治疗细菌感染性疾病的重要性。与传统治疗方法相比,应用噬菌体及裂解酶治疗细菌感染性疾病具有极大的优势:①在自然环境中存在大量的噬菌体,易分离,且能治疗耐药细菌引起的疾病；②可与其他抗菌剂如抗生素、中药成分等联合使用抑制细菌,既可治疗又可预防细菌引起的疾病；③特异性强,只针对相应的病原菌不会破坏正常菌群；④可抑制BF 形成,并清除已形成的BF；⑤可通过基因工程进行人工改造,可使噬菌体和裂解酶具有更好的稳定性和裂解能力。

尽管噬菌体及其裂解酶在治疗细菌感染方面具有很多优势,但在应用方面也面临着诸多局限,如裂解谱范围窄、裂解活性易受影响和可携带细菌毒素基因、耐药基因等问题。目前,许多科研机构都在探索解决办法,BYOUNG-JOO 等［35］将 13 株裂解性噬菌体制成鸡尾酒制剂,以克服噬菌体裂解谱窄的难题；CHENG 等［36］将裂解酶与中药成分联合使用,以降低细菌毒素对机体产生的损伤；RITA COSTA等［37］利用基因工程手段制备基因工程噬菌体,来增强噬菌体清除细菌BF 的能力。此外,还有一个主要问题是噬菌体抗性突变体的出现,但这种抗性的问题已有研究表明可通过制备噬菌体鸡尾酒或噬菌体与抗生素联合应用来克服［38-41］。由于噬菌体属于病毒,使得很多人对噬菌体治疗的安全性产生怀疑,目前尚未对噬菌体疗法建立系统的指导规范。因此,噬菌体在广泛应用前尚有许多问题需克服。

5 展 望

目前对于奶牛乳房炎治疗最常用的方法仍为抗生素疗法,但该治疗方法存在治愈率低、易产生耐药性、抗生素残留等缺点。应用抗生素治疗时往往治疗不彻底,导致病原菌在乳腺组织形成BF,引起乳腺组织持续性感染,造成奶牛乳房炎反复发作、难以治愈。寻找新的治疗手段已迫在眉睫。噬菌体及其裂解酶具有独特的进化和选择优势,不仅能高效快速地杀灭耐药细菌,而且还不易产生耐药性。此外,在防控细菌BF 方面具有特异性、安全性和高效性等特点,使其无论应用于医学领域还是畜牧生产方面均具有巨大的发展潜力。

噬菌体作为细菌的克星在相互作用过程中共同进化。通过水平基因传递和突变等方式,细菌进化出多种多样的防御机制,如阻塞受体、分泌竞争性抑制剂和产生细胞外基质等［42-43］。为了突破这些防御机制,噬菌体也不断更新自身的遗传元件,如一些噬菌体可编码解聚酶,破坏BF 完整性,削弱BF 的屏障作用［30］。已有研究显示,噬菌体及其裂解酶可与其他抗菌剂联合应用增强抗菌效果,从而协同清除生物被膜及细菌细胞［39,44-45］。因此,噬菌体及其裂解酶对于防控细菌感染具有先天的优势。采用噬菌体及其裂解酶防治奶牛乳房炎可从以下几方面入手:①预防奶牛乳房炎的发生。细菌在环境中多以BF的形式附着于物体表面,如奶牛乳区、挤奶设备、工人手套、畜舍垫料等,将噬菌体作为乳区清洗、畜舍消毒和挤奶设备清洗等日常生产过程中的消毒剂,可从源头控制乳房炎致病菌的数量,防止细菌形成BF,降低乳房炎的发生几率；②噬菌体及其裂解酶直接用于奶牛乳房炎的治疗。噬菌体及其裂解酶对高度耐药的细菌仍能保持很好的裂解作用,临床应用时可制成噬菌体鸡尾酒制剂或将裂解酶与噬菌体一同应用,进而增强对细菌和BF 的清除作用；③与其他治疗方法协同治疗。噬菌体及其裂解酶可与抗生素、中草药、消毒剂等联合使用,治疗慢性奶牛乳房炎,提高治疗效果。因此,应用噬菌体防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 是可行的。

随着越来越多的研究人员参与到噬菌体的应用研究中,将来噬菌体疗法或许可帮助人们解决因BF所导致的细菌持续性感染问题,为奶牛乳房炎反复发作、久治不愈提供新的治疗方法。