循环肿瘤DNA在妇科恶性肿瘤中的应用

陈霜，马蓉，马彩玲

循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)是指肿瘤细胞DNA脱落或者当肿瘤细胞凋亡后释放进入循环系统的DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，是一种特征性的肿瘤生物标志，通过ctDNA检测，能够检出血液中的肿瘤踪迹。ctDNA作为液体活检的一种，有时也被直接称为液体活检。

1 循环肿瘤DNA的生物学特征

在1948年，Mandel和Metais发现了健康个体血液中存在游离的双链DNA片段(cell free DNA,cfDNA)[1]。在1977年，有研究表明不同类型癌症患者血液中cfDNA的水平不同[2]。由于在癌症患者血液检测到突变的RAS基因片段，cfDNA的临床潜力得到了承认[3-4]。cfDNA可以在健康人群中检测到，通常小于100 ng/mL，而肿瘤患者通常是10～40倍[5-6]。ctDNA是cfDNA的一部分，来源于肿瘤细胞，且仅见于肿瘤患者体内。从非癌细胞向外周血和其他体液中释放cfDNA的确切机制以及其生物学特性尚不清楚，ctDNA可能通过多种机制起源于肿瘤细胞，包括凋亡、坏死和细胞外囊泡和循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)的活性分泌[7-9]。ctDNA具有原发肿瘤或转移肿瘤相同的遗传物质和表观遗传改变，具有无创评估癌症的潜能。几乎所有存在于癌细胞中的分子改变都可以在ctDNA中检测到，包括编码区和非编码区、微卫星位点、杂合子丢失(LOH)、突变、pol 多态性、甲基化和拷贝数变化等[10-11]。ctDNA水平也受疾病严重程度和许多其他因素的影响，如肿瘤位置、血管和细胞周期等[8,12- 13]。大多数的肝癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和转移性癌患者以及头颈部神经母细胞瘤和黑色素瘤患者，都可以检测到相当水平的ctDNA，而肿瘤定位于中枢神经系统或有黏液特征的肿瘤(如前列腺和甲状腺)通常只能检测到较低水平的ctDNA或不可检测到ctDNA[8,14]。由于通过肾脏、肝脏和脾脏的淋巴循环迅速清除，ctDNA在循环中有一个可变的半衰期，据报道平均在15 min左右[5]。而且，对于一个肿瘤患者来说，ctDNA来源于个别癌症病变的比例还取决于肿瘤的解剖位置和大小。此外，CTCs和转移性病变的存在也有助于ctDNA的产生[15]。

2 循环肿瘤DNA检测的相关技术

cfDNA是高度片段化的DNA，ctDNA的总量约仅占cfDNA总量的0.01%，其极低的浓度给ctDNA的检测带来了挑战，特别是在肿瘤发展的早期阶段[16-18]。目前主要有两大类检测ctDNA的方法，第一类是采用靶向测序的方法，利用原发肿瘤中已知的单个或几个肿瘤特异性突变来监测外周血中的特异性改变，这些技术包括高通量测序技术(NGS)、数字PCR技术、实时PCR技术等，该方法需要有关肿瘤基因组的详细信息，而该方法敏感性较高，可以快速检测到等位基因频率低至0.01%的突变，且具有较高特异性[19-21]。第二种方法是非靶向测序，旨在进行全基因组范围内的拷贝数畸变分析(CNAs)[22]或通过全基因组测序(WGS)或全外显子组测序(WES)点突变分析[23]。非靶向筛查方法既能够识别在肿瘤治疗期间发生的新变化，又不需要有关原发肿瘤基因组的信息，但是为了可靠地重建肿瘤特异性全基因组变化需要高浓度的ctDNA。非靶向测序方法由于成本高、检测周期长、数据分析难度较大，而且总体灵敏度较低(5%～10%)[23]，难以应用于临床。

3 循环肿瘤DNA在妇科恶性肿瘤中的应用

3.1 循环肿瘤DNA与卵巢癌

在卵巢癌的诊断方面，ctDNA有重要的临床意义，Phallen等[24]发现在42例入组的卵巢癌患者中，有71%的患者能检测出相当水平的ctDNA；Zhang等[25]发现在I期卵巢癌中，cfDNA的敏感性和特异性(分别为85.3%和90.5%)比CA125(分别为56.1%和64.15%)更高。而Parkinson等[26]发现在一组高级别浆液性卵巢癌患者中，ctDNA水平与肿瘤体积之间也有很强的关系，说明ctDNA在评估肿瘤负担中具有潜在价值。Kamat等[27]在一项小鼠研究中证实ctDNA水平升高表明肿瘤负担增加。特定ctDNA突变的存在甚至被确定为卵巢癌患者总生存时间的独立预测因子[28]，Siravegna等[29]发现卵巢癌患者ctDNA水平与术后残余肿瘤负荷>1 cm(P=0.0001)和复发风险较高(P=0.002)显著相关。在卵巢癌的复发预测方面，ctDNA可能提供无法通过影像学检查发现的复发性病变。一项研究表明，ctDNA可以比CT扫描提早7个月诊断出复发的卵巢癌病例[30]。Martignetti等[31]采用一种高敏感性和高特异性的生物标记物，即成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)融合ctDNA的生物标记物，在对特定卵巢癌患者进行为期4年的随访期间进行的28项测量中，FGFR2融合比CA125更好地反映了疾病的演变，特别是肿瘤复发。

综上所述，ctDNA对于卵巢癌的早期发现、治疗和预后及复发检测有十分重要的临床意义，也是基础和临床科研工作者研究的热点，对于卵巢癌这种起病隐匿、病死率高的疾病，希望能通过探索ctDNA与卵巢癌的临床意义，对卵巢癌的筛查、诊断及治疗预后提供重要依据，取得突破性进展。

3.2 循环肿瘤DNA与子宫内膜癌

ctDNA在子宫内膜癌方面研究虽然相对较少，但仍有研究表明ctDNA具有作为识别不同组织学亚型和等级的子宫内膜癌复发的高度敏感的生物标志物的潜力。Moss等[32]报道ctDNA可以监测正在接受治疗的子宫内膜癌患者。Margolin等[33]开展了一项研究，以检测包括42例子宫内膜癌患者在内的5种类型肿瘤中ZNF154CpG岛的甲基化程度，除组织样本外，他们的研究还使用了ctDNA的计算模拟(1%的肿瘤DNA，99%的正常DNA)，结果以0.79的AUC表明其在子宫内膜肿瘤中表现出很好的性能。有相关研究表明ctDNA可在较早的时间点识别非有效疗法，而无需等待对疾病反应的影像学评估。目前关于子宫内膜癌的相关研究很少，可能是由于子宫内膜癌早期症状较明显，且通过较简单的活检方法就可以获得病理学标本，但并不代表生物学标志物对于子宫内膜癌的临床意义较小，因此探索ctDNA对于子宫内膜癌的临床意义仍是基础和临床工作者研究的重要方向。

3.3 循环肿瘤DNA与宫颈癌

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是宫颈癌发生发展的关键一步，已有研究表明，几乎所有宫颈癌组织都能发现HPV遗传物质[34]。两种特殊的HPV亚型，HPV16和HPV18导致70%以上的宫颈癌，包括宫颈鳞状细胞癌和腺癌[34]。有研究表明宫颈癌患者血浆或血清中的HPV ctDNA在宫颈癌的诊断中具有极好的准确性[35]。最近的研究表明，大多数超过I期的宫颈癌患者都可检测到ctDNA，而且ctDNA的浓度反映了肿瘤的严重程度[36]。由于将HPV整合到人类基因组中是肿瘤发生的关键部分[37]，而且病毒基因序列与人类基因不同，所以血液中HPV DNA的检测可能反映治疗前的肿瘤负担和治疗后观察期间的复发信号。由于HPV的DNA序列与人类基因组有很大的不同，因此在ctDNA中可以更容易地检测到HPV DNA，遗憾的是，通过常规PCR只能发现12%～45%的宫颈癌患者[38-39]。由于目前宫颈癌筛查项目和疫苗接种技术已经较成熟，所以关于宫颈癌ctDNA的相关研究较少，但是探索宫颈癌生物学标志物，通过液体活检比传统病理学活检有独到的优势，如无创、更早发现等优点，因此探索ctDNA对于宫颈癌的临床意义也十分重要。

4 结论与展望

基于液体活检的ctDNA分析已迅速成为在患者监测的许多阶段进行无创癌症评估的有效策略，液体活检可以通过释放到血液循环中的不同生物标志物提供有关肿瘤的生物学和临床特征等有价值的信息。可以通过定量检测血液样本中的ctDNA或通过检测突变来分析整个肿瘤基因组。过去几年中，有研究表明了ctDNA检测和分析技术的显著进步，例如，基于NGS的方法在克服许多降低ctDNA检测的错误率和提高灵敏度的挑战方面取得了重大进展。尽管如此，基于NGS的方法仍然相对昂贵并且消耗大量时间。而基于实时PCR的技术进行的分析具有成本效益、快速且对于有限数量的生物标记物在常规临床实践中是可行的。这些技术标准化的进一步发展将使ctDNA在癌症诊断领域发挥重要作用。因此探索更经济、灵敏度和特异度更高的ctDNA检测方法具有十分重要的临床意义。妇科恶性肿瘤目前仍然困扰着临床工作者，ctDNA因具有无创、精准、比传统检查更早出现改变等优点，已成为目前科研工作者的重要研究方向，广大基础和临床科研工作者正在努力探索更好的检测方法，改进液体活检的技术，提高检测的灵敏度和特异度。虽然目前ctDNA检测尚处于临床前阶段，但是相信在不久的将来，液体活检成为临床辅助检查，结合其他临床检查更好地指导临床。