杜氏肌营养不良症的研究进展

陶原 田春梅

滨州医学院附属医院儿科，山东 256600

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种致死性的X染色体隐性遗传病，由营养不良蛋白基因突变导致营养不良蛋白缺乏［1-2］。在儿童早期发病，其特征是近端肌肉无力和小腿肥大。患者通常在12岁丧失下肢行动能力，并在十几岁至二十多岁时死于心肺并发症［3］。目前尚没有特效药物，且发病机制研究不明确，本综述描述了DMD的临床特征，临床表现和治疗方法，以及一些新型疗法的研究。

1 发病机制

DMD是由DMD基因突变引起的。DMD基因编码肌营养不良蛋白，位于肌细胞膜和肌动蛋白丝表面之间的肌细胞内，其mRNA主要在骨骼、心脏、平滑肌和大脑中表达［4］。该基因可发生各种突变，如缺失（60%～65%）、重复（5%～10%）和点突变［5］。DMD基因突变的影响主要取决于变异是否破坏了这些突变下游的阅读框。在框外突变的情况下，DMD基因的开放阅读框被破坏从而导致DMD。同时，框内突变并形成异常但保留部分功能的肌营养不良蛋白则引起贝克肌营养不良症［6］。由于突变类型的不同，骨密度表型可能有很大的变化，从无症状到边缘性DMD［6］。有研究表明，LTBP4和SPP1基因多态性的表达对患儿发病年龄有影响［7］。肌营养不良蛋白是连接肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质的蛋白质复合物的一部分，有助于支持肌肉的力量和功能。缺乏肌营养不良蛋白会导致肌肉纤维中肌浆蛋白的丢失和肌肉的广泛损伤，从而导致肌肉退化。此外，DMD肌纤维逐渐被脂肪和纤维化组织所取代，这进一步阻碍了肌肉的机械和生理活动［8］。

肌营养不良蛋白缺乏导致肌肉纤维变性的确切机制仍不清楚。质膜上肌营养不良蛋白的缺乏会导致肌营养不良蛋白相关蛋白从膜上脱离，导致细胞骨架破裂，从而导致膜的不稳定性和对机械应力的敏感性增加。涉及肌肉损伤的各种机制包括机械损伤、细胞内钙水平增加、信号分子的损伤和免疫细胞的增加等［9］。

2 临床表现

DMD患者通常从近端开始出现进行性肌无力。典型表现为肌肉无力、步态改变、肌肉假性肥大和行走困难。患有DMD的男孩通常在没有用糖皮质激素治疗的前提下在10～12岁之间失去行走能力，随着病情的发展，许多患者由于缺乏椎旁肌肉支持而发展为脊柱侧凸，从而影响呼吸，上肢功能在后一阶段下降。其他骨科并发症包括长骨骨折、骨质疏松及关节挛缩症（通常首先出现在脚踝，然后出现在臀部、膝盖、肘部和腕部）。也有认知障碍、注意力缺陷多动障碍、自闭症谱系障碍和强迫症的报道。扩张型心肌病通常在10岁以后出现，随着年龄的增长，DMD患者呼吸和心脏问题继续恶化，最终导致其死亡［10］。

3 治 疗

3.1 糖皮质激素 迄今为止，皮质类固醇（如泼尼松龙、泼尼松）已成为唯一在DMD中有效的药物。皮质类固醇改善DMD强度的具体机制尚不清楚，但目前包括改变肌肉纤维中基因的调节、减慢骨骼肌分解速度、减少细胞毒性T细胞、降低胞质钙浓度和增加成肌细胞修复。有研究结果表明，泼尼松龙、泼尼松可以在10 d内改善肌肉力量，3个月药效达最大，并可以维持18个月，且可降低呼吸系统与心脏功能及脊柱侧弯患病率和严重性。但还没有长期的随机对照试验表明，皮质类固醇会延长DMD患者失去活动能力的时间或改善长期生存率。其不良反应包括体质量增加、行为改变、免疫抑制和多毛症，少部分可出现骨折、青春期延迟、高血压、白内障及生长抑制［11-12］。

3.2 上调肌营养不良蛋白相关蛋白 Utrophin蛋白是6号染色体编码的常染色体同源物，与肌营养不良蛋白在结构和功能上高度相似［13］。在mdx小鼠（DMD模型）和金毛猎犬MD（一种DMD的狗模型）中，utrophin蛋白的上调已显示出有效的结果［14］。有研究表明，ezutromid使用utrophin A启动子片段在预防mdx小鼠的进展过程中具有积极作用，并减少了再生纤维的数量［15］，但有一项临床2期试验表明其缺乏持续疗效［16］。目前正在开发第2代内啡肽调节剂，特别是SMT022357被发现在mdx小鼠中表现出体内有效性，导致骨骼肌和心肌中肌营养因子的表达增加。目前已有研究表明，相对于ezutromid，SMT022357更能有效改善mdx小鼠的营养不良表型［17］。

3.3 核因子抑制剂 核因子κB（NF-κB）的激活可以导致肌肉蛋白降解，从而产生促炎性介质，如细胞因子和趋化因子，导致疾病发展。DMD患者可见到活化的NF-κB。edasalonexent（CAT-1004）是一种口服小分子，设计为抑制NF-κB，目前处于1/2期临床试验中。该药物处于临床试验第一阶段，该药物被证明对DMD患者安全且耐受良好，但是有报道称在治疗12周后，未能显示出明显获益［19］。在一项为期1周的针对男孩的1期试验中的第一阶段，也耐受性良好，目前需要下一步试验［18］。

脂联素也可以降低NF-κB的活性，对暴露于急性和慢性炎症的骨骼肌具有抗炎作用。之前在一项mdx小鼠的实验中证明了脂联素基因的局部给药降低了骨骼肌中几种氧化应激及炎性标志物的表达，并增加了肌源性标志物的表达，可以延缓疾病进展，通过减少肌肉发炎、损伤来改善肌肉及力量［20］。

3.4 肌肉生长抑制素抑制剂 肌肉生长抑制素（myostatin）是转化生长因子-β超家族的成员，是骨骼肌质量的负调控因子。mdx小鼠模型中肌生成抑制素的丢失或抑制可导致肌肉质量增加、力量增强、脂肪替代减少和纤维化。domagzumab与myostatin结合并抑制其活性，在实验中显示安全且耐受性良好，但近期一项2期临床试验未取得良好结果［21］。ACE-031是激活蛋白IIB型和IgG1-Fc的融合蛋白，结合肌生长抑制素和相关配体，在一项临床实验中由于其肌肉相关的不良事件最终导致终止研究［22］。胰岛素生长因子1有助于肌肉生长，目前正在临床试验中研究其在增加肌肉纤维大小方面的用途。

3.5 基因治疗

3.5.1 外显子跳跃 通常是指使用合成反义寡核苷酸抑制剪接增强子位点，以防止特定外显子参与剪接。从而将DMD转化为贝克肌营养不良症，其目的是阅读框的恢复以及部分功能性肌营养不良蛋白的产生，而不是非功能性肌营养不良蛋白的产生［23］。13%～14%的DMD患者有可能通过跳过第51外显子纠正阅读框的缺失。eteplirsen可与肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子51结合，并在mRNA加工过程中导致外显子51被跳跃。它是美国食品药品监督管理局批准的首个跳过外显子的药物（2016年9月），一项meta分析表明eteplirsen还可以改善患者呼吸功能，但尚无长期证据表明他们的长期疗效［24］。drisapersen和suvodirsen也已在临床试验中进行过评估，但由于的risapersen的不良反应（蛋白尿及血小板减少）及suvodirsen（肌营养不良蛋白并未增加）效果不佳，其临床开发已停止。针对第53外显子，golodirsen治疗的患者的肌肉活检显示，外显子53跳跃增加，有肌营养不良蛋白的产生［25］。viltolarsen也显示安全且有疗效，但仍需要进一步研究［26］。对于外显子45跳跃，casimersen的疗效也正有一项临床试验进行研究［27］。

3.5.2 基因替代疗法 基因替代疗法是指在DMD患者基因组中插入外源DMD基因，从而表达出有作用的肌营养不良蛋白。由于肌营养不良蛋白基因的分子量大和病毒载体相对携带较少，需要创建微型肌营养不良蛋白基因进行传递。重组腺相关病毒载体用于携带微量和小型营养蛋白。这种疗法在mdx小鼠中显示出成功的结果，但在一项临床试验中，患儿出现了严重的免疫反应［28］。最近，研究显示，微肌营养不良蛋白的交货使用AAV载体可以减少在DBA/2J-mdx小鼠，对于DMD严重mdx小鼠的骨骼肌炎症和纤维化，但该疗法尚未经过临床测试［29］。

3.5.3 提前终止密码子通读 提前终止密码子通读是指当提前终止密码子（Ptc）位于DMD基因的编码区域时，就会发生无义突变，翻译过程被迫终止，导致功能失调的肌营养不良蛋白形式被截断［30］。通过多项体外研究阐明，庆大霉素等氨基糖苷类药物可成功抑制多种不同MRNA中PTCs的翻译终止，恢复哺乳动物细胞中相关蛋白的生理功能。其不良作用包括如耳毒性、肾毒性［31］。但氨基糖苷类有优先与线粒体核糖体结合的特性，目前研究采用较低毒性杂交脂质体包裹的庆大霉素能有效恢复mdx小鼠骨骼肌中肌营养不良蛋白的表达，适合长期抑制治疗［32］。此外，一种非氨基糖苷类抗生素已被证实能抑制哺乳动物细胞中的Ptc。negamycin是一种肽类抗生素，修复mdx小鼠骨骼肌和心肌的肌营养不良，比庆大霉素的毒性更小［33］。另一个Ptc抑制基因是ataluren，广泛的临床前研究表明，ataluren安全可用，比抗生素具有更特定的功能（不影响脱靶部位，如溶酶体膜）。然而对于其疗效现仍有争议，目前需要进一步研究证明［34］。

3.5.4 基因编辑 使用CRISPR/Cas9系统可在mdx小鼠和犬体内进行基因编辑，可见骨骼肌和心肌中肌营养不良蛋白恢复，并伴有肌膜上DGC成分的重新定位和骨骼肌功能的改善。CRISPR/Cas9技术基组水平上模拟外显子跳跃效应，恢复DMD开放阅读框，并生成拥有部分功能的营养不良蛋白。通过CRISPR/Cas9技术，在去除mdx小鼠中突变的22、23外显子实验和在缺失DMD基因44和50外显子小鼠的实验中，取得了很好的疗效［34］。

3.6 干细胞治疗 干细胞治疗是基于异体或自体的细胞移植，其目的是再生患者受损的组织或器官，并补充特定的干细胞群。在DMD的情况下，主要的目标是用肌营养不良蛋白感受态细胞重建卫星细胞池，从而由于表达肌纤维的肌营养不良蛋白存在而恢复肌肉功能。细胞来源可以来自自体或者供体［35］。目前研究的人类细胞治疗方法可根据技术和/或使用的细胞的性质分为3类：⑴部分或完全分化的细胞，⑵胚胎干细胞，⑶诱导多能干细胞。部分或完全分化的细胞此组包括肌卫星细胞，骨骼肌醛脱氢酶阳性细胞，间充质干细胞和间血管细胞和CD133+细胞。将成肌细胞移植到免疫抑制的mdx小鼠后，看到了可喜的成果。但由于免疫反应，在一项男童的试验中并未成功［14］。但在一项mdx小鼠实验中，源于系统性抗肌萎缩蛋白表达嵌合细胞成功移植了成肌细胞DEC和间充质干细胞，结果显示有心肌功能的改善［36］。

有研究发现，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统（一种融合到dCas9中的转录激活因子）可以靶向并精确重塑内源性Oct4或Sox2基因位点，使修饰后的细胞系有效地向多能细胞重编程，这表明基因编辑和干细胞疗法相结合有望成为DMD的新疗法［37-38］。

4 总 结

DMD是一种破坏性疾病，其特征在于进行性肌无力，是由于缺乏肌营养不良蛋白引起的，在早期阶段，受影响的肌肉会经历无数次损伤和修复循环，但在后期阶段，会逐渐被脂肪和纤维化组织所替代。目前尚无DMD的治愈方法，糖皮质激素是唯一已被证明能将运动障碍延迟1～2年的药物。目前许多药物在动物实验中显示有效，但在人类中成果不明显，还需进一步研究，但是在干细胞治疗及基因治疗中显示出巨大研究、治疗前景。现阶段对DMD进行的研究，对未来其治疗提供了前进的方向。