基于生物信息数据探究肾阴虚证病理机制*

彭菊琴，王攀，杨扩，侯敏，3，高文静，杜阳，3，任钧国

1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所／中药药理北京市重点实验室，北京 100091；2.北京交通大学计算机与信息技术学院，北京 100044；3.北京中医药大学西苑临床医学院，北京 100029

证候是中医药理论体系中的核心部分，承接着中医基础理论与临床治疗，其具有内在的联系，能够反映疾病过程中某一阶段的病机，以及机体应对致病因素和体内外各种环境变化做出反应的一种功能状态，是对疾病当前本质的总结［1］。肾阴虚证是临床常见证候之一，多见于骨质疏松、2型糖尿病、原发性高血压等疾病［2－4］。肾阴为一身阴气之源，“五脏之阴气，非此不能滋”。肾阴亏虚，则全身的脏腑、经络、形体、宫窍失养，而出现虚性亢奋症状。研究肾阴虚证病理机制有助于理解肾阴虚证，提高临床辨证的准确性。既往有关肾阴虚证实质研究大多是采用“一病一证”，研究内容相对单一，缺乏多层次、多视角的研究。故本研究采用生物信息数据挖掘方法，得到骨质疏松、2型糖尿病、原发性高血压“三病”以及肾阴虚证“一证”的病证结合靶点，并进行模块分析，通路富集分析，以期揭示肾阴虚证的病理机制。六味地黄丸是经典的中医名方，在临床上被广泛应用于治疗各种肾阴虚证候，疗效显著［5］。故结合六味地黄丸－肾阴虚证方证结合靶点，对药物成分进行文献挖掘，通过“以方测证”进一步验证基于数据挖掘分析获得的肾阴虚证病理机制。

1 资料与方法

1.1 肾阴虚证症状靶点筛选根据《中药新药临床研究指导原则（试行）》［6］中肾阴虚证辨证标准，采用SymMap（Symptom Mapping）［7］（http：／／www.symmap.org／）（select：P－value＜0.5）和人类症状－疾病网络（Human Symptoms－Disease Network，HSDN）数据库［8］对肾阴虚证主要的中医症状进行检索，获得肾阴虚证中医症状靶点。

1.2 疾病靶点筛选疾病－基因网数据库（Disease－gene networks database，DisGeNET）（http：／／www.disgenet.org／）、治疗靶标数据库（Treatment of the target database，TTD）（http：／／systemsdock.unit.osit.jp／iddp／home／index），GeneCards数 据 库（https：／／www.genecards.org／）和Drugbank数据库（https：／／www.drugbank.ca）对骨质疏松、2型糖尿病和原发性高血压3种疾病进行搜索，检索词分别为“essential hypertension”“diabetes mellitus type 2”“osteoporosis”。DisGeNET和GeneCards数据库靶标筛选标准为score≥中值4倍，合并去重后分别得到骨质疏松、2型糖尿病和原发性高血压疾病靶点。

1.3 病证结合靶点筛选肾阴虚证中医症状靶点分别与骨质疏松、2型糖尿病和原发性高血压3种疾病靶点取交集，获得各自共同靶点，然后逐个导入PINA［9］（protein interaction network analysis platform，verson 3.0）平台。PINA是蛋白质－蛋白质相互作用数据库，包括来自IntAct、MINT、BioGRID、DIP、HPRD和MIPS／MPac 6个公共数据库的蛋白质相互作用数据。使用PINA平台分别检索每个共同靶点的相互作用蛋白，将得到的互作蛋白通过UniProt数据库进行基因名称的标准化，过滤标准为“Homo sapiens”和“Reviewed”，得到3种疾病的疾病靶点－肾阴虚证中医症状靶点的互作蛋白数据集。对3种互作蛋白数据集取交集，获得肾阴虚证病证结合靶点。

1.4 六味地黄丸化学成分筛选采用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http／／lsp.nwu.edu.cn.／tcmsp.php），中药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）（http：／／www.megabionet.org／tcmid／），中医百科全书（Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／Index／）和中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of TCM，BATMANTCM）（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／）数据库分别对熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓进行检索，获得化学成分相关信息。依据成分药物动力学参数（ADME），筛选口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18药物作为活性成分［10］。使用PubChem（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库对化合物分子结构进行确证，根据PubChem CID进行化合物名称的标准化和去重。

1.5 六味地黄丸成分靶点预测采用Swiss Target Prediction（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），STITCH（http：／／stitch.embl.de／，version 4.0）和TCMSP数据库预测六味地黄丸成分靶点。Swiss Target Prediction数据库和STITCH数据库检索条件设置为“Homo sapiens”，Confidence score≥0.9或Probability≥0.9，TCMSP数据库仅纳入了经过实验验证的靶点。通过UniProt数据库进行标准化后得到六味地黄丸成分靶点。

1.6 方证靶点筛选将得到的六味地黄丸成分靶点逐个导入PINA平台，搜索成分靶点互作蛋白，通过UniProt数据库标准化筛选后，获得六味地黄丸成分互作靶点。将肾阴虚证病证结合靶点与六味地黄丸成分互作靶点取交集，获得六味地黄丸－肾阴虚证的方证结合靶点。

1.7 模块分析网络模块是指网络中高度互连的节点集。通过模块识别可以降低复杂网络的复杂性，并避免网络集成过程中的信息丢失，帮助发现和揭示网络内的隐藏生物信息，是理解生物系统的关键方法之一［11－12］。采用PINA平台内置马尔可夫聚类（MCL）［13］方法分别对病证结合靶点以及方证结合靶点进行关键模块分析［14］。参数设置：选用Benjamini方法校正P值，FDR cutoff＜0.001，Minimum number ofmodules to return：10。然后使用PINA平台分别对各个模块进行GO基因本体和KEGG通路分析，保留P＜0.001富集途径。

1.8 文献验证从中国知网（CNKI）和PubMed数据库，分别对六味地黄丸中活性化学成分进行检索，通过检索到的中药成分的药理作用机制对模块分析结果进行文献挖掘验证。

2 结果

2.1 肾阴虚证中医症状靶点肾阴虚证中医症状包括11项，分别为腰膝酸软、五心烦热、心烦失眠、耳鸣、口干、咽干、盗汗、少津、头晕、大便干结、舌红。从SymMap数据库获得肾阴虚证症状靶点280个，HSDN数据库获得肾阴虚证症状靶点381个，合并去重得到肾阴虚证症状540个。各肾阴虚证中医症状靶点分布情况见图1。

图1 肾阴虚证中医症状靶点分布示意图

2.2 骨质疏松、2型糖尿病、原发性高血压疾病靶点从DisGeNET数据库获得骨质疏松459个靶点，2型糖尿病6个靶点，原发性高血压76个靶点；从GeneCards数据库获得骨质疏松318个靶点，2型糖尿病1 119个靶点，原发性高血压961个靶点，从TTD数据库获得骨质疏松35个靶点，2型糖尿病82个靶点，原发性高血压69个靶点；DrugBank数据库获得骨质疏松50个靶点，2型糖尿病121个靶点，原发性高血压180个靶点。合并去重后，得到骨质疏松疾病靶点597个，2型糖尿病疾病靶点1 205个，原发性高血压疾病靶点1 113个。

2.3 病证结合靶点将骨质疏松、2型糖尿病、原发性高血压3种疾病靶点分别与肾阴虚证症状靶点取交集，得到肾阴虚症状－骨质疏松共同靶点53个，肾阴虚症状－2型糖尿病共同靶点151个，肾阴虚症状－原发性高血压共同靶点142个。通过PINA平台分别对3类共同靶点进行蛋白互作分析，取交集后，得到1 061个病证结合靶点（见图2）。

图2 病证结合靶点及方证结合靶点筛选流程图

2.4 六味地黄丸活性化学成分筛选与靶点预测六味地黄丸中的6味中药分别从4个数据库获得397个化合物成分，其中65个成分来自TCMSP，126个成分来自ETCM，93个成分来自TCMID，113个成分来自BATMAN－TCM。标准化后去重，获得241个化合物靶点。熟地黄14个成分，山萸肉80个成分，山药54个成分，茯苓56个成分，牡丹皮24个成分，泽泻28个成分。其中13个成分为2个及以上中药所共有（见图3）。

图3 六味地黄丸成分分布Upset图

从Swiss Target Prediction数据库获得124个成分靶点，STITCH数据库获得232个成分靶点，TCMSP数据库获得78个成分靶点，合并去重后得到365个成分靶点。通过PINA平台进行蛋白互作分析后，得到六味地黄丸成分互作靶点5 964个。

2.5 方证结合靶点将1 061个病证结合靶点与5 964个六味地黄丸成分互作靶点取交集后，得到方证结合靶点882个，其中方证结合靶点占病证结合靶点的百分比为83.1%（882／1 061）。

2.6 模块分析病证结合靶点模块分析，共得到11个有效关键模块。方证结合靶点模块分析，共得到10个有效的关键模块，且均与病证结合模块相同（见表1）。10个方证结合模块GO功能富集的结果包括585个生物过程（BP），93个细胞成分（CC）和113个分子功能（MF）。10个方证结合模块KEGG富集分析获得45条KEGG途径，主要聚焦于免疫相关（33.3%，15／45），还包括癌症（17.8%，8／45），传染性疾病（包括病毒、寄生虫和细菌）（13.3%，6／45）、遗传信息处理（13.3%，6／45）和细胞过程（8.9%，4／45）等（见图4）。排名前10位的通路为细胞周期、核糖体、Jak－STAT信号通路、II型糖尿病、胰岛素信号通路、醛固酮调节钠的重吸收、RIG－I样受体信号通路、NOD样受体信号通路、RNA转运、DNA复制（见图5）。

图5 方证结合靶点富集分析

表1 病证结合靶点与方证结合靶点模块分析

图4 方证结合模块的45条KEGG通路类别频率分布情况

2.7 文献验证通过中国知网（CNKI）和PubMed数据库，分别对六味地黄丸241个化学成分进行搜索，验证发现6味中药中共有34（14.1%）种成分具有调节免疫细胞、免疫因子的作用。见表2。

表2 六位地黄丸具有免疫炎症调节功能的成分汇总表

续表2 六位地黄丸具有免疫炎症调节功能的成分汇总表

3 讨论

“异病同治”是指导临床诊疗的重要法则，也是对证候灵活应用的高度体现。在临床中，疾病的因、位、症、性等虽异，但具有相同的证候，则可采取相同的治疗方法。肾阴虚证是临床上常见的基本证型之一，基于肾藏象理论，中医“肾”即肾—膀胱—骨髓—耳、二阴—发，是包括现代医学中肾、颅脑、卵巢子宫、女性生殖、男性生殖、耳、骨、前列腺、胰腺等多个器官的一个大的系统，而非单纯解剖意义上的肾脏，故多种疾病均可表现肾阴虚证症状［63］。研究肾阴虚证的病理机制有助于增加对肾阴虚证的认识，提高辨别肾阴虚证的准确性，以便于指导临床治疗。

本研究方证结合靶点关键模块的通路富集分析发现，33.3%通路与机体免疫炎症反应相关。对排名前10位通路进行分析：其中NOD样受体和RIG－I样受体均为先天性免疫系统识别受体，在多种类型的细胞中广泛表达，发挥检测、抵抗病原体的侵袭，调节免疫，保护机体的作用［64］。NOD在细胞溶胶中一般是处于自抑制单体状态，当细菌肽聚糖（PGN）进入细胞后，NOD能够识别细菌细胞壁中保守PGN片段，并发生构象变化，从而激活下游的NF－κB和MAPK信号通路，导致促炎因子分泌以及宿主防御基因的转录上调，而发挥促炎和抗微生物反应［65］。NOD蛋白除了诱发固有免疫应答中的作用外，还可以调节适应性免疫应答。NOD单独刺激会产生以Th2依赖性的适应性免疫反应为主，而与TLR激动剂共同刺激则会促进Th1、Th2和Th17细胞发生免疫反应［66－68］。RIG－I样受体属于胞质宿主RNA解旋酶，能够识别非自身RNA信号，触发机体先天免疫应答，如I型IFN以及促炎性细胞因子和趋化因子的产生，先天免疫细胞（DC，巨噬细胞，单核细胞，ILC和γ／δT细胞）激活，以及机体适应性免疫反应（B细胞、T细胞）［69－70］。排名前10位的JAK／STAT信号通路在免疫调节和宿主防御中同样发挥着重要作用。各种I／II型细胞因子可与JAK亚基结合，导致特定JAK途径的激活，从而启动细胞因子受体以及下游的一种或多种转录因子STAT磷酸化。例如通过介导IL－23和IL－6信号传导，STAT3能够诱导Th17分化；通过介导IL－2传导信号，STAT5A／B促进Treg细胞的分化，增强Th1应答；通过介导IL－7信号传导，STAT5A／B增加B淋巴细胞生成等［71－72］。其中胰岛素信号通路能够刺激代谢过程增加，促进T细胞养分吸收以及相关的糖酵解和呼吸功能，从而增强T细胞抗原特异性增殖和促炎细胞因子的产生，以及针对流感病毒的抗原特异性免疫力［73］。方证结合靶点45条KEGG通路富集结果显示，除了免疫相关通路，还包括癌症（17.8%），传染性疾病（13.3%，包括病毒、寄生虫和细菌）。癌症与传染性疾病发生发展也涉及固有免疫和适应性免疫构成的防御屏障异常。本研究结果提示，机体免疫功能异常是肾阴虚证的病理机制之一。

已有研究分别从不同的层面探讨肾阴虚证病理机制，如全基因表达层面，IncRNA、miRNA和mRNA转录层面，也均发现多种疾病的肾阴虚证与免疫以及防御应答功能相关，涉及JAK／STAT信号通路、胰岛素信号通路、MAPK信号通路等［2－3，74－76］。本研究共得到肾阴虚病证结合靶点1 061个，六味地黄丸－肾阴虚证方证结合靶点共882个，方证结合靶点数占病证结合靶点数83.1%，同时方证结合靶点模块分析得到10个关键模块均与病证结合关键模块相同，提示六味地黄丸与肾阴虚证“方证相应”。研究发现，六味地黄丸具有调节免疫功能，能够逆转脾脏细胞增殖下降［77］，改善T细胞、B细胞的功能［78］，恢复Th1／Th2、Th1／Treg的平衡而发挥抗炎调节免疫功能［79］。进一步通过文献挖掘，发现六味地黄丸6味中药中共有34（14.1%）种成分具有调节免疫细胞和免疫因子的作用。固有免疫主要取决于遗传因素，即“禀赋”，适应性免疫则需要后天之精的充养来发挥正常功能。若肾阴阳失衡，来自先天或者后天之精的肾阴化生减少，滋润濡养宁静的功能不足，抗御内外邪气能力相对太过，导致机体处于虚性亢奋，免疫功能过度激活，则会引发多种疾病。因此，本研究对方证结合靶点富集分析，以及对六味地黄丸成分的文献挖掘，通过“以方测证”说明免疫功能异常是肾阴虚证重要的病理机制之一。

方证结合模块通路富集结果还包括遗传信息处理过程（13.3%），如核糖体、RNA转运、DNA复制等，提示“肾阴”参与中心法则的全过程，即遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，完成遗传信息的转录和翻译，以及遗传信息从DNA传递给DNA，完成DNA复制。这是所有细胞结构的生物所遵循的法则，也贯穿了人体生长发育。肾为“先天之本”，为生命之本原，肾藏精，主生长、发育、生殖、脏腑气化。由肾精分化而来的肾阴具有调控各脏腑形体官窍的生理机能，进而调控机体精、气、血、津液的新陈代谢及其能量转化。中医理论中有关“肾阴”生理功能解释也与本研究结果相符，提示遗传信息传递过程异常也可能是肾阴虚证的另一病理机制。

本研究通过对获得“三病一证”靶点进行功能富集分析，并结合六味地黄丸“以方测证”，发现肾阴虚证病理机制以免疫功能紊乱为主，同时还可能伴随遗传信息传递过程异常。本研究结果为更加充分理解肾阴虚证病理机制提供理论依据。但是本研究结果是基于生物信息数据挖掘获得，后期仍需要大量的实验进行验证。