转化生长因子超家族在骨性关节炎软骨细胞退变中的作用△

刘 帅，白伦浩

（中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁 沈阳 110004）

骨性关节炎（osteoarthritis,OA）是一种退行性关节疾病，以进行性软骨退变为主，伴随滑膜炎症、骨赘形成和软骨下骨硬化为特征。影响着全球超过2.5亿的人口，除了缓解疼痛外，目前还没有有效的药物可以阻止疾病的进展［1，2-4］。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，是关节软骨细胞外基质合成的唯一来源。随着OA的发生，软骨细胞在增殖、分化和代谢方面发生了重大变化。软骨细胞的肥大、凋亡进而软骨内骨化最终导致OA［2，3］。虽然OA病理改变过程中的分子机制尚未完全明确，但通过大量实验表明，转化生长因子-β（transforming growth factor β,TGF-β）超家族在其中扮演着极其重要的角色［4］。

TGF-β超家族是一类细胞因子，进化过程中高度保守，在所有多细胞生物体中都有发现，在许多组织和器官中都有所表达。生理条件下，动态调节着细胞生长、迁移、细胞外基质重塑及免疫功能等［5］。但在病理条件下，过度表达的转化生长因子β超家族成员通过促进细胞的异常增殖、分化及炎症反应，推动疾病的进展［6］。其在OA发生过程中所扮演的角色，亦是如此［4］。

分泌磷蛋白24（secreted phosphoprotein 24kD,Spp24）是最早在骨基质中分离的一种蛋白质，主要产生于肝脏，在骨细胞及软骨细胞中亦有所表达。主要在骨生长和骨转换中起着重要作用，但其全部功能尚未明确。由于其与TGF-β超家族成员的高亲和性，使得Spp24可以参与到众多组织及器官的生理病理活动［7］。本文就TGF-β超家族在骨性关节炎软骨细胞退变中的角色及Spp24的潜在作用做一综述。

1 TGF-β超家族配体

在分泌的生长因子和细胞因子中，TGF-β超家族因其在细胞水平和发育过程中的多种功能以及在包括癌症在内的多种疾病中的作用而备受关注。人类基因组中有33个编码TGF-β超家族多肽的功能基因。大致可分为TGF-β、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、activin and inhibin、nodal、生长分化因子（growth and differentiation factor,GDF）、抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）等亚家族［8］。通常以同源或者异源二聚体的结构存在，二硫键为其主要连接形式。与其他生长因子相比，TGF-β超家族蛋白刺激细胞增殖的方式比较温和，并且取决于细胞类型和环境。但不同的是，TGF-βs强烈抑制多种细胞类型的增殖，包括上皮细胞、内皮细胞、造血细胞和免疫细胞［9］。TGF-β超家族蛋白最突出的功能是对细胞分化的影响，因为它们在发育的各个阶段控制所有细胞系的分化。除了细胞增殖和分化，它们还发挥许多额外的细胞功能，包括促进或保护细胞死亡，促进细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白的表达，促进细胞的运动和侵袭，并控制细胞的新陈代谢。然而，尽管有丰富的信息，但大多数TGF-β超家族成员的表达和生理功能仍然不清楚，主要注意力都集中在少数TGF-β超家族蛋白上。最受关注的是TGF-βs和BMPs，其失调节或基因突变与多种人类疾病有因果关系，包括癌症、骨骼、肌肉、心血管和自身免疫性疾病［6，10］。

2 TGF-β超家族受体

TGF-β超家族成员通过与靶细胞表面的双特异性激酶受体结合来传递信号。虽然该受体家族通常被称为丝氨酸/苏氨酸激酶受体，但却具有丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶相似的结构特征；实际上是双特异性激酶［11］。这个家族成员在哺乳动物中非常少，只有12个成员，其中Ⅰ型受体有7个，分别为活化素受体样激酶（activin receptor-like kinase,ALK）1-7；Ⅱ型受体有5个，分别为TβRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB、BMPⅡ和AMHRⅡ。2个相同类型的Ⅰ型受体与2个相同类型的Ⅱ型受体组成四聚体跨膜蛋白复合物，每个二聚体TGF-β超家族配体选择性结合各自的Ⅱ型受体，相互作用后进而磷酸化Ⅰ型受体。后者随后磷酸化细胞质效应器来启动细胞内的信号级联反应，如R-Smad依赖性信号通路和非R-smad依赖性信号通路。导致细胞外信号穿过质膜进入胞浆，最终到达细胞核，调节TGF-β超家族蛋白介导的基因转录［12］。

3 TGF-β超家族受体的效应因子

Ⅰ型受体的激活导致信号通过至少两条看似独立的途径传播：R-Smad依赖性途径和非R-Smad依赖性途径。R-Smad依赖性信号通路被认为是TGF-β超家族成员特有的、规范的信号通路。Smad蛋白根据其结构和功能，可分为3种类型，受体调节型Smad （R-Smads） ： Smad1、 Smad2、 Smad3、Smad5、Smad8；通用型 Smad（Co-Smad）：Smad4；抑制型 Smad （I-Smads）：Smad6、Smad7［13］。RSmads根据结构和功能同源性可以分为两组：一组由Smad1、Smad5和 Smad8组成，受 ALK1、ALK2、ALK3、ALK6磷酸化；另一组包含Smad2和Smad3，受ALK4、ALK5、ALK7磷酸化。这种磷酸化促进了2个R-Smads与1个Smad4结合形成复合物，然后转运到细胞核，与转录因子和辅助调节因子协同激活或抑制靶基因。而I-Smad分别通过阻止R-Smads的磷酸化、抑制R-Smads和Smad4复合物的形成及R-Smads与DNA的亲和发挥作用。特定地，Smad6主要抑制Smad1、5、8信号传导，Smad7主要抑制Smad2、3信号传导，这两个I-Smad都为细胞提供了一个重要的负反馈机制来灭活R-Smad信号通路［14］。

TGF-β超家族成员也可激活非R-Smad依赖性信号通路，以加强、减弱或以其他方式调节下游细胞反应。例如通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）途径传递信号，激活转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factorβ activated kinase-1,TAK1）或细胞外信号调节激酶1和2（ERK1、2）［15］。值得注意的是，这些信号通路并不是TGF-β超家族所特有的，它们也是许多其他生长因子和细胞因子的重要信号介质。

4 TGF-β超家族与OA

OA是一种以软骨退变为主的进行性疾病，而软骨细胞作为关节软骨中的唯一常驻细胞类型，其稳态的维持与否，直接影响到OA的进展。TGF-β超家族在关节软骨发育、生长、维持和修复过程中都扮演着重要的角色。但由于各亚家族磷酸化不同的RSmads蛋白，使得身处两大阵营的TGF-β、Activin、Nodal和BMP、GDF、AMH亚家族诱导软骨细胞做出方向不同的细胞反应［16］。现如今研究最深入也是最具代表性的为TGF-βs和BMPs两大亚家族。

4.1 TGF-βs与 OA

TGF-βs是以非活性前体蛋白的形式被软骨细胞合成并分泌，在细胞外与转化生长因子β结合蛋白非共价结合并潜伏于细胞外基质，因此活化是TGF-βs信号转导的关键步骤。压缩负荷产生的机械力是活化软骨细胞外基质TGF-βs前体蛋白的重要生理激活剂。而活化后的TGF-βs既可以通过磷酸化ALK5受体激活R-Smad2、3信号通路，也可以通过磷酸化ALK1受体，激活R-Smad1、5、8信号通路，来调节不同的靶基因，而二者的结局在软骨细胞中往往是相互对抗的［17］。优势通路的选择，主要取决于配体的活化程度和不同受体间的表达水平。

在健康的滑膜关节或者是OA前期，机械力和因创伤而导致的软骨组织轻微损伤，激活了部分TGF-βs，而低浓度的TGF-βs主要以激活ALK5受体为主［18］，进而导致 R-Smad2、3蛋白的汇聚及磷酸化，通过调控靶基因，增加Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9的表达，抵消细胞外基质的分解代谢，维持软骨细胞表型；降低RUX2介导的基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13,MMP-13）、解聚蛋白样金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5）的表达及Ⅹ型胶原的合成，抑制软骨细胞肥大，阻止其终末分化，降低对细胞外基质的降解，另外还可以引导间充质干细胞聚集，诱导其向软骨细胞增殖、分化。通过修复软骨组织，维持内环境稳态，负反馈阻止OA的进程。Smad3、ALK5或TβRⅡ型受体在小鼠中的软骨细胞特异性丢失都会导致早期OA的发生［19］。不反复加载负荷的截瘫患者比OA患者丧失软骨的速度更快［20］。为了保持软骨健康，活化TGF-βs和维持有规律的负荷是保持关节软骨活力所必需的。

随着OA的进展，细胞外基质进一步降解及TGF-βs表达增加，软骨细胞暴露在过度活化的TGF-βs中，又随着年龄的增长，ALK1、ALK5的相对含量有所改变，ALK1/ALK5的比值上升［21］，Smad1、5、8通路将优先被激活［22］，使得结局朝向了相反的方向发展，软骨细胞肥大、终末分化、凋亡、软骨内骨化、周围骨赘形成，MMP-13加速着细胞外基质的降解，Ⅹ型胶原取代了Ⅱ型胶原，合成代谢的速度落后于分解代谢，TGF-βs在OA软骨细胞中的作用发生变化，由抑制疾病向促进疾病发展，负反馈调节向正反馈调节转变，OA的发展进入不可逆期，且逐渐走向终末期。

4.2BMPs与OA

除了TGF-β亚家族外，BMP亚家族在成骨和软骨形成中表现出强有力的作用。多种BMP信号通路中的关键因子，包括BMP-2、4，R-Smad1、5、8，以及两种BMP拮抗剂Noggin和Gremlin1，在关节软骨中都有明显的表达［23］，软骨细胞同样表达BMPⅠ型受体ALK1、2、3、6以及Ⅱ型受体BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB［24］。因此，BMPs也是OA发病机制中的关键调节因子，但BMPs不以前体的形式潜伏于细胞外基质中。与TGF-βs相似，BMP-2也促进蛋白多糖的合成，这对维持软骨的完整性是积极的。此外，BMP-2和TGF-β1在缺氧条件下联合使用在诱导人骨髓间充质干细胞成软骨方面有很强的协同作用［25］。然而，BMP-2在严重损伤的软骨中表达增加，加剧了骨赘的形成，尽管骨赘生长的部位大多靠近生长板。尽管与TGF-βs不同的是，BMP-2可以通过R-Smad1、5诱导生长板软骨细胞向终末分化，进而软骨内骨化，但BMP-2过表达不会导致健康或骨关节炎小鼠关节软骨的结构改变，而在实验性OA模型中它会导致严重的骨赘形成［26］。这表明在出生后阶段BMP-2的高表达可能对关节内软骨细胞没有明显的有害影响，关节软骨与骨膜等骨赘形成组织相比，对BMP2信号不是很敏感。实验证明［27］，BMPs被认为对包括关节软骨和半月板在内的关节组织的正常发育和维持至关重要，而关节软骨和半月板是预防OA发病的关键。总之，对TGF-β超家族，特别是TGF-β或BMP亚家族有更深入的了解将有助于更好地了解OA的发生和发展，并将为如何区分TGF-β家族成员的有利和有害影响提供线索。

5 Spp24在OA中的潜在作用

Spp24是一种骨基质蛋白，它似乎主要来源于肝脏，并以保护性复合体的形式输送到其他组织，但在骨细胞、软骨细胞中亦可少量表达［28］。该基因位点（Spp2）与骨密度和骨质量相关的遗传学研究表明，Spp2基因在骨生长和骨转换中起着重要作用。因其具有一个与TGF-βⅡ型受体序列相似的亚结构域TRH-1（TGF-β receptor II Homology-1 domain），使得其可以与TGF-β超家族配体结合，并影响RSmad 依赖性信号通路传导［7］。Brochmann 等［29］通过实验证明，通过与BMP-2结合，可以抑制其在异位成骨中的作用；Sintuu等［30］在重组BMP-2诱导大鼠脊柱融合的实验中，Spp24表现出完全的骨生长抑制；Tian等［31］证实了Spp24同样可以与TGF-βs结合，下调其活性。另一方面，除了对成骨的影响，还可以抑制炎症反应和依赖于BMP自分泌系统的肿瘤［32］。Tian 等［33］在 BMP 促进兔脊柱融合的实验中，Spp24降低了神经根炎性因子的表达；Lee［34］、Li［35］、Lao［36］等分别通过不同的动物模型，证实了Spp24分别在肺癌、胰腺癌、肝癌中的抑制作用。

2005年，Meng等［37］使用微阵列研究检测大鼠颞下颌关节实验性骨关节炎模型的基因表达中发现，Spp24的表达增加最多，与正常相比，早期OA增加了19倍，晚期OA增加了32倍。2014年，Balakrishnan等［38］人使用色谱分离和高分辨率质谱检测OA患者的关节液，鉴定出677种蛋白质，其中一种是Spp24。可以预见的是，Spp24的表达水平升高与骨关节炎相关。结合TGF-β超家族成员在生理和病理状态下，对软骨细胞发挥着不同的作用，Spp24是否作为一种负反馈机制，阻止疾病的进展，尚未有文献报道。另有文献报道，Spp24似乎同时具有生长因子结合特性和细胞因子受体激活特性［39］。目前对于Spp24蛋白作用的研究，仍需不断深入。

6 小结和展望

TGF-β超家族对软骨细胞的稳态或退变中都起着关键作用。TGF-β信号通路的激活对OA有很好的治疗前景。但是，TGF-β信号的过度激活可能参与了OA退变的进展。因此，迫切需要阐明TGF-β信号在OA不同病理生理阶段中的作用变化、具体的分子机制及Spp24在其中起到的作用原理。只有全面、清晰的解决了这一关键问题，TGF-β超家族和Spp24才能安全、有效的作为OA的治疗靶点。