内皮祖细胞分泌的外泌体在颅脑损伤中作用的研究进展

马小鹏 综述 张华楸 审校

颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）具有较高的发病率和病死率，是青壮年最常见的死亡和残疾原因。全球每年约有5 000 万例TBI，年经济损失约4 000 亿美元，占世界生产总值的0.5%[1]。TBI 后神经组织的损伤和修复是一个复杂的病理生理过程，多种细胞参与其中，其中外泌体介导的细胞间信号传导和相互调控具有重要意义。

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）来源于骨髓和外周血管壁，是血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）的前体细胞[2]。当组织缺血或血管内皮损伤时，EPCs被组织释放的损伤信号动员后进行迁移，前往内皮损伤部位参与修复[3]。EPCs分为早期和晚期EPCs，活化的早期EPCs 表达丰富的炎性细胞因子和旁分泌血管生成因子，以旁分泌外泌体的方式招募更多的EPCs 和ECs 形成微血管[4]，是损伤后的快速反应结果。早期EPCs 的来源是外周血管壁，外周血EPCs 含量极少，只占外周细胞的0.01%。晚期EPCs通过增殖、迁移、定位到受损内皮处，分化成血管ECs 并整合到血管网络中[5，6]。晚期EPCs的来源是骨髓中的EPCs。早期EPCs和晚期EPCs 的作用方式具有差异，提示EPCs 可能具有不同的治疗作用。已有研究发现TBI 后EPCs 分泌的外泌体对脑微血管修复和改善预后具有有益影响[7]。

外泌体是介导细胞间通讯的小囊泡，有类似细胞膜的磷脂双分子层，为内部的小分子物质提供了较稳定的环境。外泌体是一种理想的载体，可将mRNA、miRNA或蛋白质运送到受体细胞中，而不会在循环中被酶消化。透射电镜观察发现，EPCs外泌体的外观结构呈椭圆形膜性囊泡，较多的EPCs外泌体聚集在一起呈葡萄状排列，大小不等，纳米颗粒跟踪分析显示平均直径为120 nm。近期的研究发现囊泡因内容物不同呈现出不同透亮度，其主要成分为mRNA 和蛋白分子[6]。对早期EPCs外泌体进行免疫印迹试验分析，发现其能高强度表达CD9、CD63 和热休克蛋白70[7]。

EPCs 作为TBI 后外泌体来源的主要途径之一，其作用和意义逐步为人们所认识。本文就EPCs 外泌体在TBI中的作用研究进展进行综述。

1 EPCs分泌的外泌体在TBI中的作用

1.1 修复损伤的血脑屏障TBI常伴随血脑屏障的破坏。血脑屏障由多种细胞和神经元构成，其中毛细血管壁的ECs 具有细胞间紧密连接蛋白，构成血脑屏障的主要结构基础。在生理条件下，血脑屏障为脑组织选择性通透营养物质，同时保护脑组织不受有毒物质侵害，确保中枢神经系统功能正常执行。

内皮集落形成细胞（endothelial colony forming cell，ECFC）是从人脐带静脉血中分离得到的早期特异性EPCs。Gao 等[7]从ECFC 条件培养基中分离出ECFC 外泌体并用细胞膜染剂PKH67 标记后，静脉输入TBI小鼠体内，12 h后观察到ECFC外泌体被大鼠微血管ECs 高效摄取；伤后24 h，ECs 向创面的迁移量显著升高；不同含量ECFC 外泌体预处理ECs后，显著增加紧密连接蛋白的表达。这说明ECFC可能通过旁分泌的方式刺激ECs的增殖和迁移。有研究报道等[8，9]从人脐血中分离单核细胞培养扩增为ECFC，静脉注射到TBI 小鼠体内24 h 后，荧光原位杂交发现在受伤的大脑中检测到标记的ECFC，明显减轻脑水肿程度，增加紧密连接蛋白的表达；小鼠运动能力、空间获取和参考记忆能力显著改善。这表明ECFC在TBI后可以直接定位到损伤部位，参与新血管形成并改善神经功能。因此，TBI后ECFC兼有早期EPCs 和晚期EPCs 的特征。ECFC 既通过外泌体的方式促进受损血管内皮的修复，其本身又可定位至受损部位，分化成ECs整合到血管网络中。

1.2 促进血管内皮的修复TBI 导致ECs 损伤，使血管平滑肌细胞增殖，常会导致微血管狭窄。Kong 等[10]发现在大鼠颈动脉球囊损伤模型中，EPCs 外泌体能抑制新生内膜的过度增生，对ECs 修复起到保护作用。Li等[11]在大鼠颈动脉内皮损伤模型中用荧光染料标记EPCs并收获其释放的外泌体，标记的外泌体与ECs 共培养后，外泌体被捕获并转移到ECs 的核周区域，显著增强ECs 的增殖。Hu 等[12]进行RNA测序发现miR-21-5p在EPCs外泌体中高度富集，并特异性抑制受体ECs中血管生成抑制因子血栓反应蛋白-1的表达。

1.3 抵抗缺氧 李罗成等[6]发现低氧可引起ECs损伤，体外缺氧环境处理的人脐静脉ECs 增殖、迁移能力下降，凋亡细胞比例上升；EPCs 外泌体显著改善缺氧条件下ECs 增殖、迁移能力。Wang 等[13]用小鼠骨髓中分离的单核细胞，在体外饥饿应激培养基中培养EPCs并提取饥饿应激EPCs外泌体明显提高血管ECs 一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和NO 水平，保护血管ECs 免受缺氧诱导的活性氧族的影响；同时，PI3K 抑制剂可以消除饥饿应激EPCs 外泌体的这些保护作用。这提示饥饿应激EPCs外泌体通过PI3K/eNOS/NO通路发挥作用。

2 调控EPCs外泌体分泌的因素

2.1 血糖水平 研究发现高血糖抑制EPCs 外泌体的释放和相关基因的表达[14，15]，使TBI病人血液中EPCs数量减少。当暴露于高葡萄糖时，人脐带ECs 的活力和成管能力显著降低，而衰老细胞的比例则明显增高。Hassanpour等[14]将人骨髓来源的EPCs分别与糖尿病和健康人的血清共培养后，糖尿病组EPCs外泌体数量较对照组显著减少，与外泌体分泌和运输的相关基因表达下调。这提示糖尿病对EPCs 分泌外泌体的效率产生不利影响。

2.2 孕激素Li等[16]制备小鼠TBI模型后腹膜内给予孕激素，发现循环EPCs水平增加，受伤脑组织CD34和CD31 阳性细胞的数量和血管密度增加。这表明TBI后孕激素可显著改善神经功能并促进血管重塑。

2.3 运动锻炼Ma等[17]分别从久坐和低、中度运动组小鼠中分离血浆EPCs外泌体，用高糖和缺氧诱导的ECs损伤模型与三组EPCs外泌体共培养研究ECs的保护因素，结果发现EPCs 水平和EPCs 外泌体在中度运动小鼠体内的释放率明显增高；运动组EPCs含量及其释放的外泌体miR-126的表达明显增高。这提示运动可能通过增加EPCs 外泌体的释放和外泌体中miR-126的含量增强对ECs的保护作用。

综上所述，TBI 后脑血管内皮组织损伤、缺血释放多种细胞因子，活化的早期EPCs通过旁分泌外泌体作用于ECs，并招募更多的EPCs 促进组织修复。当骨髓中的EPCs 受各种因素的刺激后开始动员向外周血迁移形成晚期EPCs，增加外周血中EPCs 的数量并分化成血管ECs 修复损伤。EPCs 外泌体的保护作用表现为修复损伤的血脑屏障、促进血管内皮的修复和帮助ECs 抵抗缺氧损伤。EPCs 作为干细胞移植的替代治疗方案，具有促进血管再生作用[18]。由于免疫排异等问题，EPCs 的临床应用十分有限[19]。EPCs外泌体具有与EPCs相似的作用，但其主要成分是不具有免疫原性的小分子核酸，因此，EPCs 外泌体有望成为改善TBI 预后的治疗手段[20]。近年来，EPCs被发现对神经修复和脑血管再生具有重要意义[21～23]，但EPCs 外泌体是否具有其父本EPCs的这一重要作用尚待更多研究证实。