游离胎儿DNA检测对高危产妇胎儿染色体异常诊断价值研究

林 曼， 许 莉， 张 燕， 黄翠燕， 方金华， 温海燕

海口市妇幼保健院 妇产科，海南 海口 570203

对孕妇进行有效的产前诊断、预防染色体异常畸形胎儿出生是优生优育的重要任务[1]。目前，我国主要应用的染色体核型检测手段为介入性诊断，包括绒毛活检和羊水穿刺，但介入性产前诊断具有一定的创伤性，使流产率和胎儿致畸率升高[2]。游离胎儿DNA(free fetal DNA，cffDNA)在孕5周时即可被检出。有研究发现，cffDNA检测有利于成功筛查13、18、21-三体综合征[3]。本研究旨在探讨cffDNA检测对高危产妇胎儿染色体异常的诊断价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取海口市妇幼保健院自2018年1月至2019年6月收治的2 623例产前检查单胎妊娠孕妇为研究对象。孕妇及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 高风险筛查 超声仪(美国GE公司Voluson E型号)检测胎儿颈部透明层厚度；抽取孕妇血液，在2 h内进行血清分离，检测血清β-人绒毛膜促性腺激素水平和妊娠相关血浆蛋白A浓度。通过分析孕妇的基线资料(年龄、孕周、体质量、吸烟史等)及检测的胎儿颈部透明层厚度、血清β-人绒毛膜促性腺激素水平、妊娠相关血浆蛋白A浓度，采用中位数倍数法，进行风险值计算分析，分析软件为MultiCalc 2000，风险截断值为1：270。筛选出高危孕妇，给予其绒毛活检和cffDNA检测。

1.3 绒毛活检 腹部超声指导下，导管通过孕妇子宫口或腹部，穿刺取胚胎绒毛部，约20～30 mg，将取出的绒毛部组织立即置于无菌生理盐水中，显微镜下观察，取优质部分用手术刀切碎成糊状，移入离心管中，加入1 ml胰蛋白酶消化5 min，3 000 r/min离心10 min，弃上清，1640培养液吹打均匀后，放入孵箱中培养，待克隆体形成较好后，进行染色体核型检测。

1.4 cffDNA检测 抽取孕妇10 ml静脉血，置于含有EDTA的抗凝管中，2 h内进行血浆提取，4℃、3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，吸取上清液，移入离心管中，再次4℃、3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，留取上清液，置于-80℃冰箱中保存。用QIAamp DNA Blood Mini Kit血液DNA提取试剂盒提取400 μl血浆，获得DNA 50 μl DNA溶液，将所得DNA样品置于-20℃下保存待测。设计引物序列DYS14F：5β-GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC-3′；设计引物序列DYS14R：5β-GCCCATCGGTCACTTACACTTC-3′；探针序列：5β-(FAM)TCTAGTGGAGAGGTGCTC(TAMRA)-3′(上海赛默飞世尔科技有限公司)。引物置于-20℃保存。采用Rotor Gene 3000 FQ-PCR仪对提取的样品溶液DNA进行扩增，Qubit文库进行定量，上机测序。采用BWA map软件对测序得到序列与人类基因组参考序列进行比对，用Z值估量样本数据，Z值>3时为异常。

2 结果

经过高风险筛查，2 623例孕妇中，125例诊断为高危产妇，因其中的23例孕妇需在孕15周后行羊水穿刺检查、2例孕妇为Rh阴性血型，最终100例孕妇同时接受了绒毛活检和cffDNA检测。100例孕妇平均年龄(28.65±2.64)岁，平均体质量(131.43±6.72)kg，平均孕周(12.34±2.67)周，4例有既往不良妊娠史。绒毛活检中：32例染色体异常，包括21-三体综合征10例、18-三体综合征10例、45，XO 12例；68例未见异常。cffDNA检测中：30例染色体异常，包括21-三体综合征10例、18-三体综合征8例、45，XO 12例；70例未见异常。以绒毛活检为“金标准”，cffDNA检测的敏感度为93.75%(30/32)，特异度为100.00%(68/68)。

3 讨论

cffDNA几乎全部来自于胎盘滋养层细胞[5]，其在孕5周时即可被检出[4]，随着孕周的增加而增加，且在分娩2 h后迅速消失，不影响下一胎检测，因此，cffDNA被认为是无创性产前诊断的最优检测指标之一[6]。有研究报道，在329例孕妇中，cffDNA检测出了全部的25例13-三体综合征，以及37例18-三体综合征中的34例，因此，检测母体血浆中的cffDNA作为孕早期非介入性产前检查手段十分可行[7-9]。本研究结果显示：以绒毛活检为“金标准”，cffDNA检测的敏感度为93.75%(30/32)，特异度为100.00%(68/68)，敏感度和特异度均较高。但cffDNA检测也存在一些不足：(1)方法复杂，失败率高，需要保证研究中的样本储存环境和操作步骤严格符合要求[10]；(2)孕妇孕周和体质量指数的增加会导致母体脂肪组织脱落，使血浆cffDNA升高，造成假阳性结果[11]；(3)费用昂贵，给孕妇及家庭造成经济压力[12]。

综上所述，cffDNA检测对21-三体综合征、18-三体综合征、45，XO等染色体异常疾病的诊断敏感度和特异度均较高，在孕早期进行此项检测可降低染色体异常畸形胎儿妊娠率。