Brillouin显微镜测量角膜生物力学性能的研究进展

严梦迪 高蓉蓉 王俊杰 王勤美 黄锦海

作者单位：温州医科大学附属眼视光医院 325027

角膜是眼球光学系统的重要结构，其屈光力占眼球光学系统总屈光力的2/3以上。探索角膜的生物力学性质在角膜形状与透明度的维持、圆锥角膜的诊治、屈光手术的设计以及人工角膜的研发等方面有重要参考意义[1]。目前，角膜生物力学研究的离体实验包括单轴拉伸实验[2-4]、全眼球膨胀实验[5]等，在体测量的仪器较少，主要有眼反应分析仪（Ocular response analyzer，ORA）和可视化角膜生物力学分析仪（Corneal visualization Scheimpflug technology，Corvis ST）。Brillouin显微镜可以实现在体角膜生物力学特性的无接触测量，提供微观的三维分布，有望成为临床角膜生物力学测量的新技术[6]。本综述将阐述Brillouin显微镜的测量原理、安全性以及与其他设备的比较，并总结其临床应用进展。

1 Brillouin显微镜的测量原理和结构

Brillouin光谱长期应用于材料表征和环境传感[7]，并在20世纪80年代早期开始用于生物组织[8]。分子的热波动产生以声速传播的压力波动，即声波。声速与组织的纵向模量（M'）成比例。Brillouin光散射是由光和组织中的内在声波相互作用产生的。光从组织反射时产生的多普勒频移与焦点处组织的声速成比例，可间接反映该处组织的纵向模量。Brillouin频移与组织的纵向模量之间存在着如下关系[9]：其中νB是Brillouin频移，n是组织的折射率，λ是入射光的波长，M'是纵向模量，ρ是组织的密度，θ是入射光与散射光的夹角。角膜组织的折射率和密度之间遵循Gladstone-Dale关系[10]，ρ/n2的比率在角膜中的变化很小[11]，故通过测得的频移可计算出角膜组织的纵向模量。纵向模量是指复合材料在沿正轴纵向单轴拉伸或压缩载荷作用下，在线性变化的范围内产生单位长度的线应变所需要的应力大小。杨氏模量（E'）也是用于表示组织抵抗形变能力的物理量，代表各向同性的弹性组织的刚度，定义为在遵循胡克定律的情况下，单轴应力和单轴应变之间的比值。经验证明，Brillouin测量的纵向模量和杨氏模量是对数线性关系：log（M'）=alog（E'）+b，其中a和b是组织依赖性系数，如猪眼的a=0.093、b=9.29，牛眼的a=0.034、b=9.50[12]。

Brillouin显微镜由激光扫描共聚焦显微镜和双重虚拟成像阵列（Virtually imaginary phased array，VIPA）光谱仪组成[13]，将低功率窄带近红外激光束聚焦到角膜组织中，通过高分辨共聚焦光谱仪分析来自焦点处的Brillouin频移[14]，求得纵向模量。激光束在不同部位的扫描，可反映出组织每个部位的纵向模量[6]。

2 Brillouin显微镜的安全性

眼部最大允许暴露量（Maximum permissible exposure，MPE）定义为激光在不引起生物危害的情况下进入人眼的最高功率或能量密度，相当于有50%概率会造成伤害的剂量的十分之一[15]。根据国际非电离辐射防护委员会（International Commission on Non-ionizing Radiation Protection，ICNIRP）的标准，对于波长范围为400～1 050 nm的连续波光源，照射时间在10 s以内，角膜的暴露极限为4 W/cm2，即直径为1 mm的圆形区域（面积为0.79 mm2）的MPE为32 mW。对于直径为7 mm的圆形区域视网膜，照射1 s和60 s的MPE分别为265 mW和95 mW[16]。Brillouin显微镜使用的是低功率激光，并且采集时间相对较短，不会对人眼造成危害。目前各个研究所采用的激光功率和采集时间具有较大差异，但均处于以上安全范围之内，例如Scarcelli和Yun[17]使用0.7 mW的780 nm激光，采集时间为0.4 s；Webb等[18]使用10 mW的532 nm激光，采集时间为0.2 s；Seiler等[19]使用5 mW的780 nm激光，采集时间为0.7 s。

3 Brillouin显微镜与其他设备的比较

临床现有的角膜生物力学特性的在体测量设备包括ORA和Corvis ST，二者都基于测量角膜对空气脉冲的动态形变反应。ORA是第一个应用于临床，评估活体角膜生物力学性能的仪器，利用空气脉冲使角膜压陷，产生1个双向压平的动态过程，电子光学分析系统监测角膜形变的过程，记录2个压平压力测量值，通过计算得到角膜滞后量（Corneal hysteresis，CH）及角膜阻力因子，可诊断圆锥角膜等角膜疾病[20-22]。但由于CH受角膜厚度、硬度、眼内压以及角膜水合作用的影响，并不能真实反映角膜生物力学特性。Corvis ST利用Scheimpflug高速摄像实时动态记录中央8 mm直径范围的角膜受压后横截面的完整形变过程，同时可分析记录最大变形幅度、最高凹陷时间、峰峰距离、中央角膜厚度、DAratio、SPA1和角膜生物力学指数（Corneal biomechanical index，CBI）等，其中CBI已被证明可提高圆锥角膜检测敏感度[23]。ORA基于动态双向压平的原理，Corvis ST采用气冲印压技术，二者在测量过程中都需要产生1个空气脉冲使角膜凹陷，通过形变过程中的各个参数来间接分析角膜生物力学特性，对患者造成不适感。此外，ORA和Corvis ST均将角膜视为一个各向同性的组织，该均一化假设违背了角膜各向异性的特点，不能反映角膜各部分的生物力学差异，故诊断敏感性有待进一步提高。二者用于角膜交联术后角膜硬度改变的评估，不同研究之间结果存在差异。此外，目前二者提供的角膜形变参数尚无法求出角膜本构参量。Brillouin显微镜在测量过程中无需对角膜施加外力，具有更高的测量舒适性，可以直接读出组织的局部特征，提供微观的角膜生物力学特性三维分布图[24]。Brillouin显微镜提供的纵向模量可以直接代表材料的本构属性。

4 Brillouin显微镜在角膜疾病方面的应用

4.1 正常角膜的基线数据

目前Brillouin显微镜的主要波长为780 nm。关于正常人角膜的Brillouin频移参考值范围尚无统一观点，Yun和Chernyak[6]测得780 nm波长下正常人角膜的频移在5.69～5.76 GHz之间的狭窄范围内；Scarcelli和Yun[17]观察到频移在角膜前部的100～400 μm处从5.6 GHz缓慢下降至5.5 GHz，而在角膜后部200 μm处从5.5 GHz急剧下降至5.2 GHz，Brillouin频移的这一急剧下降可能在生物力学上反映了角膜结构的改变。其他研究者也报道了相似的结果[8，25]。Scarcelli等[24]研究中的测量值与上述值存在差异，其测得角膜上皮的频移为6.5～6.6 GHz，角膜基质为6.5 GHz。

由于声速随组织中的水含量而变化[26]，Brillouin测量对角膜水合作用较敏感，或许是上述角膜频移有偏差的原因。近期有研究显示，志愿者醒来后1 h角膜厚度逐渐减小，而Brillouin频移增加[27]。Seiler等[19]使用不同浓度的右旋糖酐对兔角膜脱水后进行Brillouin测量和角膜条带拉伸试验后显示，高浓度（20%）的右旋糖酐处理后的角膜纵向模量和弹性模量分别是低浓度（5%）处理后的1.2倍和4.4倍，且随着角膜脱水程度的变化，纵向模量与角膜厚度呈负相关，并首次证明了纵向模量不随应力的变化而改变，即Brillouin测量无法描述角膜组织的非线性特征。有研究通过对离体牛角膜进行水化处理令角膜明显膨胀，26 h后角膜厚度几乎加倍[28]，此时水合作用明显超过正常水平[29]，且测得角膜所有深度的Brillouin频移减小，表明肿胀的角膜变得更柔软。0.5 h时，角膜前部的频移为6.3～6.5 GHz，后部为6.2～6.5 GHz，26 h后减小为6.0～6.3 GHz[28]。此外，肿胀的角膜中测量的频移变化表明组织内的结构完整性丧失，符合角膜过度水合和水肿的常见变化[30，31]。Brillouin测量对水合作用的敏感性可能与胶原纤维和细胞外基质的可压缩性有关，也可能反映了组织的结构和分子变化。

人眼角膜缘的Brillouin频移值低于中央角膜，特别是在角膜的最前部区域[28，32]，上皮下存在10～15 μm厚的Brillouin频移最高的组织，推测为前弹力层[32]。目前采用Brillouin显微镜对角膜组织进行的研究较少，其角膜各部分的正常参考值范围有待进一步大样本量、多中心的研究。

4.2 角膜疾病的诊疗和筛查

4.2.1 Brillouin显微镜与圆锥角膜的诊断 圆锥角膜是一种退行性眼病，其特征在于生物力学减弱的角膜局部在眼内压的作用下进行性变薄和前凸。目前对该疾病的诊断多依赖于角膜地形图和Corvis ST，但早期的诊断和鉴别较困难。开发一种测量角膜力学性能的仪器十分有必要，有助于圆锥角膜发展机制的探索，圆锥角膜的早期诊断和早期干预，还有助于LASIK术后角膜膨隆的筛查。较多研究比较了圆锥角膜和正常角膜的Brillouin测量值，认为二者之间存在明显差异。Scarcelli等[33]对比了8个健康角膜供体和10个晚期圆锥角膜，在取下角膜后2 h内，使用波长为532 nm的Brillouin显微镜测量，得到圆锥角膜前200 μm的平均频移为（7.99±0.10）GHz，明显低于健康角膜的（8.17±0.06）GHz，且差异有统计学意义（P＜0.001）。此外，该研究中，在圆锥角膜内，远离锥顶区的频移显著高于锥形区。最近，Seiler等[34]比较了47例健康眼与36例圆锥角膜眼，同样证明了圆锥角膜锥体中央区的频移均低于健康眼。Shao等[35]比较了正常角膜与不同阶段圆锥角膜患者的Brillouin测量结果，显示正常角膜测量值在中央与周边无明显差异，且左右眼具有较高的对称性，随着圆锥角膜的进展，其生物力学的不均匀性以及左右眼间的不对称性均增加。此外，I、II期的圆锥角膜与正常角膜差异无统计学意义，I期锥体内两眼的差异约24 MHz，但晚期患者Brillouin频移测量值明显降低，为100～200 MHz。

4.2.2 Brillouin显微镜与角膜胶原交联术（Corneal collagen cross-linking，CXL）的疗效 CXL出现于20世纪90年代，在2003年开始用于治疗进展期圆锥角膜，能显著增强角膜的生物力学性能。同时，CXL也能治疗角膜炎[36]、角膜溶解[37]、角膜基质水肿[38]等病变。Randleman等[9]评估了11只猪眼的基线状态、制作LASIK皮瓣造模后以及快速CXL术后的角膜不同深度的Brillouin频移，结果显示，制作皮瓣后，前部和中部区域角膜的频移较基线显著下降，而后部的降幅较少；再行快速CXL术后的频移比制作皮瓣后略微增高，但术后角膜任何深度的频移增高与制作皮瓣后的频移相比差异都无统计学意义。Scarcelli等[39]对新鲜猪眼进行CXL后，其纵向模量明显增加，且前基质层的增加幅度大于后基质层。Webb等[18]采用不同强度但总能量相同的紫外线进行猪眼CXL，观察到术后纵向模量和弹性模量较未处理组均有增加，且2种模量的增加具有一致性，增幅随照射强度的增大而减小，CXL的效果局限于角膜前中部。以上研究反映出Brillouin显微镜可以评估CXL后角膜组织不同深度的生物力学变化，但该变化与交联方案之间的具体关系有待进一步探索。

5 展望

Brillouin显微镜为角膜生物力学特性（纵向模量）的测量提供了一种安全、非接触和三维的方法，其发展有望将生物力学本构参量测量引入临床，在许多角膜疾病的诊断和治疗上具有广阔的前景。目前对Brillouin显微镜测量角膜纵向模量的算法和模型有待进一步优化。此外，目前Brillouin显微镜在眼科其他疾病中的应用较少，未来还可以通过更多的研究来扩展其应用价值。然而，要将Brillouin显微镜广泛应用于临床上，仍需要进一步大量的研究数据。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明严梦迪：收集文献资料并归纳分析，撰写论文，根据修改意见进行论文修改。黄锦海、高蓉蓉：参与选题设计，指导资料的分析和解释，参与论文的修改。王俊杰、王勤美：对论文的知识性内容作批评性审阅