小檗碱抗肿瘤作用机制研究进展

程靖，周小杰（.黄山市产品质量检验研究院 黄山市药品不良反应监测中心，安徽 黄山 245000；2.浙江中医药大学中医药科学院，杭州 30053）

肿瘤严重危害人类健康，国际癌症研究机构（IARC）发布的数据显示，2018年全球新增癌症病例约有1810万例，肿瘤导致死亡病例约960万例，预计到2030年，年新增病例数将达2360万[1]，因此，寻找预防和治疗肿瘤的有效药物至关重要。小檗碱是一种从黄连、黄柏等中草药中提取分离的小分子异喹啉生物碱，对消化系统、心血管系统、神经系统等疾病具有广泛的药理活性[2]。虽然小檗碱在临床治疗肿瘤鲜有报道，但是大量的体内动物和体外细胞研究证实，小檗碱对胃癌[3]、乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝癌[6]及其他肿瘤[7]均具有显著的抗肿瘤作用，是一个潜在的抗肿瘤药物，但目前对小檗碱抗肿瘤的作用机制研究仍不明确，本文拟从小檗碱对细胞周期和凋亡、细胞自噬的调节、肿瘤细胞的侵袭和转移的抑制、肿瘤微环境、microRNA表达的调节、端粒酶活性以及肠道菌群的调节等方面，探讨小檗碱的抗肿瘤作用机制。

1 小檗碱对细胞周期的调节

正常细胞转变成肿瘤细胞与细胞周期密切相关[8-9]，细胞周期受细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调节，肿瘤细胞始终处于增殖状态不能进入静止期。研究表明小檗碱可调节细胞周期抑制肿瘤细胞增殖，Sakaguchi等[10]在研究中分别用1 μmol·L－1和10 μmol·L－1的小檗碱处理乳腺癌MCF7细胞和非致瘤性上皮MCF12A细胞，发现小檗碱能通过增加p53蛋白表达减少CDK抑制蛋白（CDKI）p21的表达，从而抑制这两种细胞系的细胞增殖，使其停滞于G0/G1期。用X线与小檗碱联合处理HepG2细胞，发现小檗碱可增加肿瘤细胞的氧化应激，减少线粒体的ATP水平，显著抑制细胞增殖，有很好的G2/M阻滞作用[11]。王佳豪等[12]研究认为小檗碱可以显著抑制肠癌Caco-2细胞增殖，其作用机制可能与阻滞细胞周期于G2/M期从而诱导细胞凋亡有关。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，小檗碱能够下调修复交叉互补基因1（XRCC1）的表达，使细胞停滞于S期，并诱导DNA断裂，增加肿瘤细胞对化学疗法的敏感性[13]。Xiao等[14]研究表明小檗碱是通过抑制Cyclin D1和Cyclin E1的表达将A549肺癌细胞周期阻滞在G1期，小檗碱还可以抑制Rb蛋白的磷酸化，从而阻止转录激活因子E2F从Rb上解离，并抑制了从G1到S期的转变。上述研究均表明小檗碱可通过调控细胞周期进程来抑制肿瘤细胞的增殖。

2 小檗碱对细胞凋亡的调节

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种调控形式。主要有两条途径，第一条为细胞质途径，由死亡受体Fas（肿瘤坏死因子受体超家族的成员）与Fas配体（FasL）结合启动凋亡信号的转导激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8（caspase-8）引起细胞凋亡；第二条是线粒体途径，线粒体释放的细胞色素C在dATP存在的条件下与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，激活caspase-9，被激活的caspase-9能激活其他的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡，线粒体还释放凋亡诱导因子（AIF），参与激活caspase。在白血病HL-60细胞中，小檗碱可通过增加caspase-8和caspase-9的表达激活caspase-3，从而促进肿瘤细胞凋亡[15]。在皮肤鳞状细胞癌A431细胞中，小檗碱可通过增加细胞色素C的释放激活caspase，从而诱导细胞凋亡[16]。在神经母细胞瘤中，小檗碱通过增加Bax、caspase-3蛋白表达，减少Bcl-2蛋白表达诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长[17]。小檗碱与大黄素联合应用可显著抑制乳腺癌细胞中盐诱导性激酶3（SIK3）的表达，从而导致乳腺癌细胞生长减少，细胞周期停滞和细胞凋亡增加[18]。

3 小檗碱对细胞自噬的调节

自噬也是细胞程序性死亡的一种方式，是一种重要的胞内物质代谢分解过程，可通过溶酶体吞噬及降解自身结构蛋白及细胞器，使细胞进行再循环，在维持细胞稳态中起着重要作用。在病理条件下，自噬通常被认为具有保护作用，肿瘤生长、发生和抑制过程中起关键作用。近年来，小檗碱对自噬的调控已被广泛研究。Liu等[19]研究表明，小檗碱通过抑制蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素复合物1（Akt/mTORC1）信号转导途径诱导EU-6和SKW-3细胞自噬，显示出治疗急性淋巴细胞白血病的潜力。在乳腺癌中，小檗碱通过调节c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化并促进B淋巴细胞瘤-2/beclin-1（bcl-2/beclin-1）复合物的解离而诱导细胞自噬死亡[20]。在对胃癌的治疗中，小檗碱可触发胃癌BGC-823细胞自噬，通过MAPK/mTOR和Akt信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖[21]。但是，另外一些研究表明，小檗碱可抑制细胞自噬，Wang等[22]用小檗碱处理对阿霉素耐药的MCF-7乳腺癌细胞发现小檗碱通过调节PTEN/Akt/mTOR信号通路来充当潜在的自噬抑制剂，阻止自噬相关蛋白LC3Ⅱ的积累，从而抑制细胞自噬。自噬介导的耐药性在肿瘤发展中起着重要作用，并且肿瘤细胞通过调节自噬来逃避凋亡，小檗碱可能通过调节miR-30家族来抑制beclin-1表达，显著降低脂肪细胞自噬。

4 小檗碱对肿瘤细胞侵袭和转移的抑制

肿瘤的主要特征是肿瘤细胞的侵袭和转移，肿瘤细胞能够通过血液或淋巴系统迁移并侵袭人体的不同组织或部分，从而形成新的肿瘤，在恶性肿瘤患者中，肿瘤细胞的侵袭和转移是导致死亡的主要原因。Zheng等[23]对乳腺癌细胞MDA-MB-231研究中发现，小檗碱在正常情况下不会影响细胞活力，但能够降低刮擦伤口模型中肿瘤细胞的迁移能力，从而延长伤口愈合时间。Ma等[24]研究表明小檗碱通过在乳腺癌细胞中靶向抑制Ephrin-B2并抑制基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的表达来抑制细胞增殖和转移。小檗碱还可通过下调转化生长因子-β1（TGF-β1）抑制MMP-2和MMP-9的表达[24]，通过上调钙黏附蛋白E（E-cadherin），下调波形蛋白（Vimentin）及转录因子Snail1、Slug的表达，抑制TGF-β1诱导的上皮向间充质转化，以防止肺癌的侵袭和转移[25]。血管生成在肺中叶恶性肿瘤的进展和转移中起着关键作用，研究表明[26]，小檗碱能够抑制肿瘤细胞中血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达，诱导eEF2磷酸化，导致VEGF表达降低，从而抑制细胞的侵袭和转移。此外，在SW480大肠癌细胞中，小檗碱通过下调GRP78的表达来抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[27]。在三阴性乳腺癌细胞中，小檗碱通过抑制TGF-β1和下调Smads抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[28]。上述研究均提示小檗碱能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

5 小檗碱对肿瘤微环境的影响

肿瘤细胞分泌细胞因子改变周围的肿瘤微环境，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。在骨肉瘤中，小檗碱下调caspase-1/IL-1β信号传导途径改变了炎症微环境，导致细胞凋亡[29]。小檗碱可以在乳腺癌细胞系MCF-7中上调抗癌细胞因子β-干扰素（IFN-β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[30]。在自身免疫性疾病中，小檗碱通过与T细胞和DC细胞直接相互作用来抑制Th17反应[31]；可通过抑制IL-1β信号传导和抑制软骨损伤来改善骨关节炎[32]；通过抑制IL-2、IL-6等促炎性基因的表达来影响巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用[33]；通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ROS，从而保护PC-12细胞免受氧化损伤[34]。小檗碱通过阻断IL-6和TNF-α，抑制炎症反应驱动的EGFRERK信号传导，并对结肠炎相关的大肠癌发挥抗肿瘤作用[35]。此外，Du等[36]成功构建了氧化石墨烯负载的新型化疗药物小檗碱衍生物B3的酸性肿瘤微环境条件和近红外激光双应答，实现了对肿瘤细胞的靶向协同治疗。总之，小檗碱可通过影响炎症反应和免疫分子等来调节肿瘤的微环境。

6 小檗碱对microRNA的影响

MicroRNA（miRNA）是一类长度在19～23个核苷酸的单链小分子非编码RNA，通过与3'-非翻译区的结合，参与RNA沉默和基因表达的转录后调控。在细胞增殖、凋亡、分化和器官发生等许多生物过程以及人类疾病（如肿瘤、糖尿病）中，miRNA都已成为重要的调控元件。许多miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关[37]。小檗碱可通过调节miRNA的表达或与其相互作用来抑制肿瘤的侵袭和转移。Feng等[38]研究发现，小檗碱可能通过TP53、Erb和MAPK信号通路部分抑制3个miRNA簇（miR-99a～miR125b、miR-17～miR92和miR-106～125），从而抑制多发性骨髓瘤，其中，miR-99a～miR125b群集可能是多发性骨髓瘤治疗的新靶标。小檗碱还可通过IL6/STAT3下调miR-21的转录和表达，诱导多发性骨髓瘤细胞株的凋亡、G2期细胞周期阻滞和集落抑制。在肝癌细胞中，小檗碱通过调节miR-22-3p和SP1及其下游靶标cyclin D1（CCND1）基因和Bcl-2来抑制肿瘤细胞的生长[39]，上调miR-23a的表达介导p21和DNA损伤诱导基因（GADD45α）的转录激活[40]。小檗碱可上调miR-101的转录，调节子宫内膜癌细胞中COX-2的转录，从而抑制子宫内膜细胞的生长、迁移、侵袭和转移[41]。在结肠癌细胞中，小檗碱可下调miR-429并抑制E-cadherin表达，可能是治疗结直肠癌的潜在治疗药物[42]。尽管研究表明小檗碱通过与miRNA相互作用抑制肿瘤的侵袭与转移，但相互作用位点和作用机制有待进一步探讨。

7 小檗碱对端粒酶活性的调节

端粒酶是细胞中基本的核蛋白逆转录酶，其活性在正常细胞中受到抑制，而其异常激活会导致肿瘤细胞的增殖不受调控[43]。研究表明，小檗碱和麻风树碱衍生物可通过靶向调节端粒酶活性，诱导线粒体功能障碍，端粒DNA损伤和细胞周期停滞，诱导膀胱T-24肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗膀胱癌的作用[44]。小檗碱可抑制AP-2与人体端粒酶反转录酶（hTERT）启动子的结合，从而导致hTERT表达降低和肿瘤细胞永生化的逆转[45]。另一项研究表明，小檗碱稳定了内源性端粒G-四链体的结构，抑制hTR与该复合物的结合，从而抑制端粒酶的活性[46]。以上研究提示，小檗碱可通过抑制端粒酶活性，影响细胞的凋亡、增殖、细胞周期阻滞等发挥抗肿瘤作用。

8 小檗碱对肠道菌群的调节

肠道菌群作为一个微生态系统，人体肠道内的微生物可参与合成体内必需氨基酸、维生素，调节代谢以及促进矿物质的吸收，可通过作用于靶器官，调节宿主的稳态，但当体内的微生态平衡被打破时，机体维持正常生理功能的能力减弱，会使疾病更容易发生，肿瘤的发生发展与肠道微生物的结构、种类及丰度密切相关。Gao等[47]对131名结直肠癌患者的粪便微生物群特征进行研究，发现肿瘤患者的肠道菌群具有明显的真菌生物失调和真菌网络的改变。Wang等[48]研究发现高脂肥胖的Apcmin/＋直肠癌小鼠肠道微生物在个体间差异较大，在野生型小鼠的肠道菌群中主要有厚壁菌、拟杆菌、变形菌和疣微菌，在对Apcmin/＋小鼠高脂饲养后，疣微菌比例明显增加，小檗碱干预能减轻小鼠的直肠癌进展并且改变了小鼠肠道菌群结构，提示小檗碱可能是通过肠道菌群来减缓直肠癌进程。Yu等[49]的进一步研究表明，肠道定植具核梭杆菌能诱导小鼠直肠癌的发生，经过小檗碱干预后，具核梭杆菌、链球菌、肠球菌等致病菌水平明显下降，小鼠中IL-21/22/31、CD40L的分泌以及信号传导与转录激活因子3磷酸化（p-STAT3）、p-STAT5和细胞外调节蛋白激酶1/2磷酸化（p-ERK1/2）的表达均呈现明显的逆转，这表明小檗碱可通过调节肿瘤微环境阻断肿瘤发生相关通路的激活。

9 总结

综上所述，小檗碱可通过调节细胞周期抑制肿瘤细胞的分裂生长；抑制细胞增殖并抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；影响炎症反应和免疫分子等来调节肿瘤的微环境；调节microRNA的表达或与其相互作用来抑制肿瘤的侵袭和转移；抑制端粒酶活性，影响细胞的凋亡和周期阻滞等；调节肠道微生物来抑制肿瘤。提示小檗碱可用来开发治疗肿瘤，但对小檗碱的应用仍然面临许多难题，如小檗碱水溶性差、肠道中吸收率低、口服生物利用度低等。因此，对小檗碱开发利用需要进一步的研究，Chang等[50]合成的6个小檗碱衍生物较小檗碱具有更强的抑制肿瘤细胞增殖作用，通过研究表明，在C9和C13具有取代基的新型小檗碱衍生物显示出明显增强的抗肿瘤增殖活性。联合用药可减轻化疗药物的毒副作用，可通过纳米技术构建共传递系统将小檗碱与化疗药物同时递送至肿瘤细胞[51-52]，相信随着对小檗碱研究的持续深入，有望使其成为一种有效的抗肿瘤药物。