从健康人尿液筛选年龄相关蛋白质

郑舒心，赵敏迪，邵 晨，孙海丹，刘晓燕，郭正光，孙 伟*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 药理系，北京 100005；2.北京医院 国家老年医学中心 检验医学科，北京 100730； 3.国家蛋白质科学中心(北京) 北京蛋白质组研究中心 北京生命组学研究所，北京 102206)

近年来，尿液逐渐成为寻找疾病标志物的重要来源[1]。但是，尿液生物标志物发现的主要瓶颈之一是尿液蛋白的浓度和组成受到许多因素的影响，包括年龄、性别、饮食等[2]。因此，健康人尿蛋白质组的个体差异分析可以排除疾病标志物发现过程中个体差异的影响，为蛋白质组学研究提供背景，具有重要的临床价值[3]。

目前已有报道健康成人尿液中的个体差异蛋白，但以往分析多数是研究性别相关差异蛋白，且年龄相关差异蛋白研究深度不足[3-4]。本研究对正常人尿液进行蛋白质组分析，试图发现与年龄相关的尿蛋白，为后续的年龄相关蛋白质组学及疾病标志物研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象:尿液样本来自中国人民解放军总医院第一医学中心。受试者为29名20～69岁的健康成年人。所有受试者都没有急性或慢性疾病，在收集尿液时也没有服用任何药物。受试者年龄分组信息表1。所有受试者均签署了知情同意书，本研究得到了中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会的批准(伦理审批号：047-2019)。

表1 受试者年龄分组Table 1 Groups based on age of urine donors

1.1.2 试剂:二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、尿素、硫脲(Sigma-Aldrich 公司)；胰蛋白酶(质谱级)(Promega公司)；乙腈、甲酸、乙醇、碳酸氢铵均为色谱级(Merk公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取及酶切：尿液样本5 000×g/min 离心 30 min，去掉尿沉渣。上清液用 3 倍体积的乙醇在 4 ℃ 冰箱过夜后 10 000×g/min 离心 30 min 得到尿蛋白沉淀。沉淀用裂解液溶解[7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 0.1 mol/L二硫苏糖醇和50 mmol/L三氨基甲烷(Tris)]，37 ℃ 静置 1 h，加入 1 mol/L 的碘乙酰胺至终浓度 0.05 mol/L，室温避光 45 min。样本转移到 10 ku 超滤膜上用缓冲液 (7 mol/L 尿素和 50 mmol/L Tris)清洗两次之后，用 25 mmol/L 碳酸氢铵溶液再清洗两次。处理后的样品在 25 mmol/L碳酸氢铵溶液中用胰蛋白酶消化。消化后的肽段从10 ku的过滤器中洗脱，在C18柱上脱盐。

1.2.2 肽段预分离：29 个样本及混合的质控样本肽段首先用高效液相色谱柱(4.6 mm×250 mm，3 μm) 进行预分离，多肽的洗脱液梯度为 5%～35% B 液(90% 乙腈)，流速为1 mL/min，洗脱时间为30 min。每分钟收集一个组分，抽干后溶解于 0.1%甲酸水溶液，按照6～7、 8～9、 10～11、 12～13、 14～16、17～19、 20～22和 23～26 将收集的组分合并为 8 个组分。

1.2.3 质谱分析：上述样品的各个组分均采用相同的 LC-MS/MS 参数进行分析。多肽样品采用毛细管色谱柱(75 mm×100 mm) 进行分离，多肽的洗脱液梯度为 5%～30% B 液(0.1% 甲酸，99.9%乙腈)，流速为300 nL/min，洗脱时间为 40 min。洗脱的肽段用TripleTOF 5600质谱仪分析鉴定，分析模式采用数据依赖采集模式，参数如下: 一级全扫描分辨率为 40 000；二级扫描分辨率为20 000; 电荷筛选范围(+2～+4); 二级全扫描范围为100 m/z～1 800 m/z，动态排除时间为15 s，扫描时间为100 ms。本实验总计共进行了272 次LC-MS/MS质谱分析，包括29个样品的232次分析以及5次技术重复Q 样品的40次分析。

1.3 统计学分析

1.3.1 定性分析:质谱数据应用 Mascot (Matrix Science 公司，2.5.01版本)软件进行数据库检索，数据库为 SwissProt 人类蛋白质组学数据库(www.uniprot.org, 20 121 条序列)。搜索参数为: 胰蛋白酶酶切，误切位点为 2 个，母离子和子离子的质量精确度为 5 ppm，固定修饰为半胱氨酸的脲基甲基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化(+43.00 ku)。获得的数据库搜索结果由Scaffold进一步处理(版本 4.0.7)蛋白水平的假阳性率为小于1%。

1.3.2 非标记定量分析:应用 Progenesis LC-MS软件(版本 4.0)，将其电荷数筛选为 +2 到 +5 对蛋白质进行鉴定和定量分析。P<0.05且变化倍数大于 2 或小于 0.5 的蛋白为差异蛋白。

1.3.3 生物信息学分析:用 SIMCA 软件(版本 14.1)对蛋白进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，用 IPA (Ingenuity Pathway Analysis)软件对差异蛋白进行通路富集分析。

2 结果

2.1 尿液蛋白质组的分析及年龄相关蛋白的筛选

在14名健康男性的尿液样本中定量到1 683个蛋白质，在15名健康女性的尿液样本中定量到1 679个蛋白质。通过计算5个QC重复中蛋白质丰度的差异系数(CV)来评估该分析的技术差异，技术差异系数CV中位数为0.24。男性组与女性组中每种蛋白质的生物差异分别用14名男性和15名女性尿样中所测蛋白质丰度来评估，男性组生物差异系数CV中位数为0.54，女性组生物差异系数CV中位数为0.55，都显著高于技术变异系数中位数(0.24)。将两组定量到的蛋白质分别做PCA分析，结果表明男性组和女性组各自3个年龄段组之间的尿蛋白质组表现出明显的分离趋势(图1)。

对男性和女性组分别进行年龄相关蛋白分析。根据P<0.05且蛋白表达显著性差异倍数大于2倍为标准筛选差异蛋白(图2)。男性组和女性组与年龄相关的差异蛋白质分别有100个和94个，共同的蛋白有12个，其中11个为上调蛋白，1个为下调蛋白(表2)。

2.2 年龄相关蛋白的生物信息学分析

男性组中上调的通路功能主要集中在维生素代谢、糖代谢及凝血系统；下调蛋白代谢通路功能主要集中在免疫系统、疾病以及肌醇磷酸代谢。女性组中上调蛋白的通路功能主要集中在维生素代谢、氨基酸代谢以及脂质代谢；下调蛋白的通路功能主要集中在免疫系统以及疾病(图3)。

3 讨论

健康人尿液蛋白质组的研究可以为疾病的诊断和监测提供基础。有研究表明随着年龄的增长会导致许多疾病的发生，如心血管疾病[5]、关节炎[6]及癌[7]等。因此更深入的了解随年龄增长相关蛋白质组学的变化有助于衰老疾病机制的研究，并促进新的抗衰老疗法等研究的发展。

随着年龄的增长，蛋白质生物合成普遍减缓，与物质营养代谢相关的许多酶的表达量降低，导致参与碳水化合物代谢、维生素代谢、能量代谢等过程中的化合物的生成明显减少[8]。无论男性组或女性组中在青年组均发生上调的一个重要蛋白是亚甲基四氢叶酸脱氢酶 1 (C-1-tetrahydrofolate synthase，MTHFD1)，它是一种叶酸代谢途径中的关键酶，是合成胸苷酸、嘌呤核苷酸和蛋氨酸的底物[9]。本研究中MTHFD1参与的代谢通路主要有叶酸多聚谷氨酸、组氨酸降解III及叶酸转化I，说明随年龄增长会发生氨基酸及叶酸代谢程度的降低。有实验表明MTHFD1在肾肿瘤组织中的表达明显低于健康人肾组织，同时MTHFD1表达增高的患者5年生存率明显提高。这些结果证实了MTHFD 1对肾癌细胞的抗肿瘤作用[10]。年龄增长过程中MTHFD 1的表达量降低也许会导致细胞凋亡减少和癌细胞增值加快而导致癌症等疾病的发生，但具体机制有待进一步研究。

图1 男性组女性组PCA分析Fig 1 PCA analysis of male and female groups

图2 男性组和女性组差异尿蛋白火山图分析Fig 2 Volcano analysis of differential proteins of male group (A, B) and female group (C, D)

表2 男性组和女性组共同的12个差异尿蛋白Table 2 Twelve differential urine proteins overlapped in male and female groups

图3 男性组女性组差异表达蛋白代谢通路分析Fig 3 Pathway analysis of differential proteins of male group (A) and female group (B)

总之，本实验对男性女性不同年龄段健康成年人尿液应用蛋白质组学的方法来分析年龄相关的蛋白组特征。分析结果揭示了高龄人群与低龄人群的尿液蛋白质组差别，这表明利用尿液蛋白质组可以反映年龄相关的变化，有可能利用尿液发现年龄相关标志物，并进行年龄状态的评估。