生猪屠宰场中沙门菌的传播特点和防控新技术

彭通通，潘明星，孟闯，焦新安，潘志明

(扬州大学/江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009)

沙门菌属于肠杆菌科，分为邦戈尔沙门菌和肠道沙门菌2个种。绝大多数沙门菌属于肠道沙门菌，可分为2 600多种血清型[1]。不同血清型沙门菌的宿主适应性不同，某些沙门菌血清型可感染多种宿主导致疾病，例如猪的猪霍乱沙门菌一般可造成猪的系统性疾病，也会影响哺乳动物宿主，宿主限制性的沙门菌血清型只能造成单一宿主的伤寒疾病，例如猪的猪伤寒沙门菌和人的伤寒沙门菌等；其中泛宿主沙门菌可在广泛的宿主中造成疾病，常见于鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌等[2]。沙门菌是最常见和广泛分布的食源性病原体之一，是引起全球人类胃肠炎和细菌血症的主要原因之一。虽然我国缺乏对沙门菌的官方系统监测数据，但据估计22.2%的食源性疾病是由沙门菌引起的[3]，其中70%～80%的细菌性食物中毒由沙门菌引起[4]，且引起沙门菌中毒的食品中90%以上是动物性产品[5]。马呈珠等[6]对山东省1983—2002年间沙门菌食物中毒情况进行分析，共发生沙门菌食物中毒286起，其中15人死亡，11 228人中毒。沙门菌不仅在我国感染严重，还是世界范围内最重要的人兽共患病原菌之一，至2010年在全球造成了7 800万例食源性疾病和59 000人死亡[7]，对食品安全造成了严重危害。

随着社会经济的发展，人们对肉类食品的需求日益增大，导致病原微生物引起的食源性疾病日益增多。自20世纪90年代初以来，猪肉被认为是人类沙门菌病的重要来源[8]。猪易受多种血清型沙门菌的感染，特别是鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒单相变异株和罗森沙门菌，而且德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌及鼠伤寒单相变异株与大多数人类感染沙门菌病例相关。被感染的猪通常是健康的沙门菌携带者，这些亚临床感染的猪可能会在粪便中排出沙门菌，或将细菌留在肠道、淋巴结及扁桃体中。据报道，被感染的猪是屠宰场和加工环节最主要的污染源[9]，笔者所在实验室对某规模化大型半自动屠宰场进行了连续3 年的流行病学调查， 2016年3月至2019年12月间共采集2 256 份样品，沙门菌总分离率达29%，污染遍布所有屠宰环节，可见生猪屠宰场沙门菌交叉污染严重。本文将重点介绍沙门菌在猪肉加工环节中的污染现状及防控措施研究进展。

1 生猪屠宰场沙门菌的传播

1.1 “养殖场-屠宰场”的沙门菌来源

生猪屠宰环节是肉品受沙门菌污染的关键风险点之一，由于屠宰环境、日屠宰量、屠宰场规模的不同，不同地区屠宰环节的沙门菌污染率有所不同[10]。生猪屠宰场位于养猪业的下游及猪肉销售的上游，是减少猪肉生产链中沙门菌流行的关键环节[11]。为了对沙门菌的污染进行有效控制，需了解沙门菌的来源。Patchanef等[12]对泰国清迈及周边地区猪肉零售店中沙门菌的传播进行了研究，利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和沙门菌地理分布分析发现多个来源的沙门菌间具有亲缘关系，表明猪肉生产链中的沙门菌存在“养殖场-屠宰场”传播途径。Colello等[13]利用细菌基因组重复序列PCR技术(ERIC-PCR)对来自养殖场、屠宰场及猪肉零售样品中的沙门菌分析显示，沙门菌菌株间具有克隆相关性，表明养殖场的沙门菌可垂直传播到屠宰场及零售环节。在生猪养殖环节，无论是受污染的猪还是受污染的饲料、车辆、靴子、过道、野生动物等，都是造成猪场环境污染的重要原因[14]。育肥猪的污染是猪养殖场沙门菌污染的关键点。在育肥猪运输到屠宰场的过程中，处理、装载、高密度放养、环境和温度的变化、长时间运输等都会给育肥猪造成应激反应，使携带沙门菌的猪产生粪便并导致交叉污染。有研究调查了中国四川省18个养猪场、下游屠宰场和市场的沙门菌分布，经脉冲场凝胶电泳(PFGE)发现猪养殖场的沙门菌交叉污染严重，下游屠宰场也被养殖场的沙门菌污染[15]。养殖场的沙门菌被运输车辆携带到生猪屠宰场，这种高度污染的环境增加了沙门菌污染屠宰场的可能。据文献报道，育肥猪暴露在受污染的环境中2 h就可受沙门菌污染[16]，因此，如果屠宰环境受污染，待宰生猪很易在待宰圈被污染。

1.2 生猪屠宰场内的交叉污染

生猪在待宰圈休息时会造成交叉污染，待宰圈清洗时也会造成生猪的交叉污染。胴体水平的沙门菌污染是屠宰场最关键的污染环节之一，在屠宰设施中发现了2种沙门菌来源：第1种是屠宰场环境中存在沙门菌；第2种是受污染的猪传播沙门菌。环境中存在的沙门菌菌株已成“本地菌群”的一部分，长期污染屠宰场的猪胴体[17]。屠宰线上的污染主要来自于放血、烫毛、脱毛、劈半、抛光等半机械半人工屠宰区域，屠宰操作的不规范会造成严重的交叉污染，操作工人也会携带沙门菌进入屠宰场。研究发现10.3%的屠宰猪淋巴结中携带沙门菌，8.3%的猪胴体被沙门菌污染。许多研究表明，在放血环节猪体表面会受到高水平的污染，当携带沙门菌的猪胴体经过各个屠宰环节时会通过屠宰人员的手或刀具将沙门菌传递到其他胴体产生交叉污染[18]。笔者所在实验室对江苏省不同类型猪屠宰场的流行性调查发现，猪放血后呈高水平的沙门菌污染，总分离率达46.9%，是屠宰环节中仅次于去内脏环节沙门菌污染最严重的环节。烫毛和脱毛等过程可减少沙门菌污染，但烫毛水和刮毛刀具的反复使用易被猪携带的泥土、粪便中的沙门菌污染，导致烫毛池和刮毛刀具也成沙门菌的传播污染源[19]。在劈半过程中，受污染的劈刀可传播沙门菌。Zhou等[11]经过对中国淮安某大型半自动化屠宰场的沙门菌流行性规律监测发现，在猪胴体劈半环节的沙门菌污染率达55.9%，是沙门菌流行率最高的污染环节。在屠宰场规范性操作中，去内脏是重要的屠宰环节，肠胃道的肠系膜和回肠、盲肠、淋巴结，以及头部的下颌或咽后淋巴结往往是沙门菌在猪体内的藏身之处。不规范的屠宰程序和检验程序会导致猪体内的沙门菌在屠宰线上扩散并造成猪胴体污染。Bonardi等[20]对两家日屠宰量为3 000头的生猪屠宰场进行了沙门菌的流行性调查，在猪胴体和屠宰工具上检测到了亲缘性关系极高的沙门菌，证明了屠宰程序与猪胴体之间存在严重的交叉污染。尽管还需更多的研究来深入探究屠宰场沙门菌的流行病学规律，但屠宰场沙门菌污染的防控需从屠宰操作和屠宰环境的消毒入手，通过最少的成本获得最高的效益，这是猪屠宰场生产实际中最易实现的防控手段。

2 沙门菌的快速检测及分子分型技术

沙门菌常见于肉类、加工肉类、含有肉类的加工食品和加工过程中被污染的食品。因此，快速准确地检测沙门菌感染对肉类加工业、食品安全和人类健康至关重要。沙门菌分子分型技术可快速准确地追踪沙门菌污染源，检测出不同来源的沙门菌，为沙门菌的防控奠定基础。这些新检测技术未来用于屠宰环节的沙门菌检测，将为肉类食品安全和公共卫生提供重要的保障。

2.1 快速检测技术

随着食源性致病菌的危害日益严重，快速筛查受污染食品是预防和控制食源性疾病暴发的关键。国家标准的沙门菌检测方法依赖于常规的微生物培养方法，利用培养基进行增菌及分离纯化，将纯化后的菌落进行生化鉴定，国标法是沙门菌检测的金标准，但操作繁琐、耗时长。中国农业大学Zhang等[21]研究了一种使用铁纳米团簇放大和智能手机成像技术来快速检测沙门菌的毛细管生物传感器，利用操作简便的多柱毛细管、可信号放大的铁纳米团簇和可图像分析的智能手机APP实现快速灵敏地检测沙门菌，但现阶段检测的样品体积有限，不适合大体积检测目标菌，而且玻璃毛细管易碎。Preechakasedkit等[22]建立了一种快速检测沙门菌的免疫层析试纸法，该方法已成功用于检测人血清中的沙门菌，特异性和准确性达100%，其在屠宰场沙门菌现场检测中的应用潜力具有重要研究意义。杨美荣等[23]建立了实时荧光PCR技术检测饲料中沙门菌，并对空白饲料、人工污染饲料和自然感染饲料进行了检测，结果均与国标方法一致。Fachmann等[24]提出了一种可以帮助屠宰场节省工作时间和冷藏成本的快速检测方法，是可兼容快速循环实时PCR检测和样品制备的一种方法。近年来，利用环介导等温扩增(LAMP)的核酸扩增技术成为食品沙门菌PCR检测的新方法。徐文文等[25]通过优化引物浓度及熔解曲线分析判断扩增靶标的来源，建立的二重LAMP法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。Liu等[26]将LAMP和色谱测流试纸结合用于沙门菌的快速检测，此技术对肠炎沙门菌检测的灵敏度是常规PCR的1 000倍。Han等[27]将单叠氮丙酸和LAMP技术相结合用于检测病原微生物，显示出较好的定量能力，是一种快速、灵敏、可靠的检测方法。随着人们对沙门菌危害性的认知日益增加，沙门菌的检测技术也在不断提高，目前国标法依然是金标准，但是其操作繁琐、耗时长，不利于现场检测。建立的新型检测方法常具有一定的局限性，比如实时荧光PCR及生物传感器的方法需要进行沙门菌培养，需要一定的培养时间。免疫层析试纸法与LAMP联用的方法对于屠宰场沙门菌的快速检测具有很大潜力，检测范围从食品到工业产品皆有涉及，未来对于LAMP技术仍需进一步研究，包括DNA的提取和现场检测所需的存储方法及样品制备方法。

2.2 分子分型技术

快速分子分型技术可提供更快、更具区分性和更准确的沙门菌分型，克服了传统血清分型的局限性[28]。其中包括脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和全基因组测序(WGS)等几种常用的方法。其中WGS分型具有的高通量、高准确性及卓越的鉴别力使其优于其他分型方法，正迅速成为沙门菌分型的首选方法和金标准。PFGE主要是使用限制性内切酶进行酶切，将DNA片段化，通过不断改变电流方向(脉冲场)，将大片段镶嵌在琼脂糖凝胶上，使DNA按大小分离，为分离株生成特定的“指纹图样”。PFGE暂时不能实现自动化，还需高水平的专业操作技能，因此，通量不足会阻碍大批量试验。MLST是利用Sanger测序技术对核苷酸序列进行测序的分型方法，主要是通过测序评估菌株中的7对“管家基因”的DNA变化来完成分型的。传统的MLST比PFGE更快更便捷，但是鉴别力不高[29]。多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)是一种基于PCR的分型方法，起源于法医学。MLVA可分析的沙门菌血清型是特定的，因此不同的沙门菌血清型需要不同的MLVA方案[30]。该方法只需常规的PCR步骤进行毛细管电泳，与PFGE相比，MLVA的劳动强度小，耗时少，更易执行，而且减少病原菌的处理时间有利于大规模调查。但MLVA只能运用于特有的血清型，具有较大局限性，并且目标位点的快速进化可能会降低MLVA分析的准确性[31]。

全基因组测序(WGS)可捕获单个微生物分离株中整个基因组的DNA序列变化。该数据可用于评估进化来准确描述分离株的遗传相关性，使用WGS可对暴发调查和病原体来源追踪中的沙门菌进行分型[32]。WGS可使用Illumina测序系统进行测序，后者是使用最广泛的测序平台之一。WGS技术的分析方法主要包括高质量单核苷酸多态性分析(hqSNP)、全基因组多位点序列分型(wgMLST)和核心基因组多位点序列分型(cgMLST)等几种[33]。hqSNP分析是指使用原始序列数据识别一组密切相关的分离株的SNP差异，这些数据被映射到参考基因组进行对比，hqSNP分析只对从祖先分离株垂直转移到当前分离株的SNP进行分析。wgMLST分析是利用单个基因组与数据库的比较，该数据库包含一组已知菌株(即血清型、亚种、种和属)泛基因组的所有等位基因[34]。cgMLST方法与wgMLST方法相似，主要区别在于数据库的大小和性质。金宣辰[35]对来自生猪屠宰场的67株德尔卑沙门菌进行WGS分析，在基因组层面说明屠宰场中存在交叉污染，并且通过WGS分析结果找到了沙门菌的关键控制点。Kawakami等[36]对2次暴发的沙门菌流行病学数据进行WGS分析，证实了其高度相关，发现屠宰场的猪是鼠伤寒沙门菌单相变异株的主要来源。PulseNet(美国细菌分子分型国家电子网络)已经将WGS定义为将要取代PFGE和MLVA的常规分子分型工具，PHE(世界卫生组织公共卫生部)已经取消PFGE等分型方法开始使用“实时”WGS对沙门菌分离株进行分型[37]。Torpdahl等[38]对包括25种血清型的110株沙门菌进行了分子分型分析，结果显示MLST区分为43个亚型，而PFGE区分为73个亚型，可见PFGE的分辨率要高于MLST；在另一项对52株肠炎沙门菌不同分子分型鉴别方法的研究中，PFGE结果是分为8个亚型，MLVA分为18个亚型，WGS分为34个亚型，PFGE、MLVA、WGS的区分力分别为0.81、0.92、0.97[39]，可见WGS具有最高的分辨力。随着成本的持续下降和易用性的增加，WGS技术将越来越多地用于食品行业的污染事件调查，WGS分型对沙门菌的高分辨率有望提高在食品工业中追踪和控制沙门菌污染的能力，并且成为公共卫生当局和食品监管机构的食品安全新标准。

3 生猪屠宰场的沙门菌防控措施

生猪定点屠宰场是不同地区出栏生猪及其产品的集散地，由于生猪的来源复杂、运输应激、高度集中等诸多因素，生猪定点屠宰场还是生猪传染病的易发地，必须高度重视其传染病的防控工作。现阶段屠宰场的防控多使用消毒剂和有机酸等便宜便捷有效的方法，其中消毒剂是屠宰场使用最广泛的消毒方式，噬菌体作为生物抗菌剂有望在生猪屠宰环节使用，具有极大的发展前景。

3.1 消毒剂

有研究选择爱尔兰一家屠宰场对8种清洁及消毒方案消除和降低猪屠宰场待宰圈内沙门菌的能力进行评估，结果显示用季铵盐类混合消毒剂和氯甲酚类消毒剂进行密集清洗后再晾干最有效[40]。Gosling等[41]调查了15种消毒剂对猪相关沙门菌的杀灭能力，结果显示氯甲酚和戊二醛/甲醛产品对沙门菌的清除效果最好。罗薇[42]选用7种不同的消毒剂开展沙门菌消减能力评估试验，结果显示癸甲溴铵的效果较好。消毒剂的使用可有效地清除屠宰场的沙门菌，但是消毒剂的种类要经常进行更换评估，防止沙门菌对消毒剂产生耐受性。在屠宰场中清洗和消毒可有效减少生猪围栏地板和金属杆上的空气污染，但残留的污染仍存在，清洗后使用消毒剂消毒并减少牲畜的休息时间，可有效减少空气污染指数。总之，单靠高压清洗不能有效地减少生猪屠宰场围栏内沙门菌的流行，配合使用消毒剂对屠宰场进行沙门菌的消减才是最便捷便宜的防控方法。

3.2 有机酸

有机酸已较多地应用于屠宰场，与消毒剂不同，有机酸可喷淋于肉类表面达到消减沙门菌的目的。有研究评价了丙酮酸和琥珀酸对肉类中沙门菌的抑菌作用，结果显示能有效降低沙门菌载量[43]。据调查，将乳酸与磷酸氢钠组合可减少肉类中沙门菌的产生[44]。董瑷榕等[45]探讨了苯甲酸、富马酸及其2种酸组合的复合酸对常见致病菌的体外抑菌效果，结果显示有机酸对沙门菌等3种致病性菌具有明显的体外抑菌活性。在屠宰场使用有机酸来消除病原菌被普遍认为是一种安全、有效的方法。

3.3 噬菌体

噬菌体是传统抗菌剂的天然替代品，其可有效地控制食品工业中的细菌病原体的暴发及传播，利用噬菌体进行食品工业中沙门菌的防治具有广阔前景。据报道，噬菌体的应用已成功减少了各种食品中沙门菌的数量。Whichard等[46]将沙门菌噬菌体Felix-O1接种于香肠中，结果发现鼠伤寒沙门菌减少了2个对数单位。现如今，通过将噬菌体与动物性食品和食品中的其他微生物结合起来，也可以提高噬菌体的效力，例如“噬菌体鸡尾酒”。Spricigo等[47]将3种不同的噬菌体组成了一种噬菌体鸡尾酒，对生猪皮肤上的肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的生长进行了检测，结果显示对这2种沙门菌的杀菌率分别大于2lg cfu/cm2和4lg cfu/cm2。有研究报道，将噬菌体、乳酸链球菌素及山梨酸钾组合使用可大量降低鲜猪肉上的沙门菌和其他肠杆菌[48]。为了能更广泛的在食品工业中使用，应该从不同角度去证明噬菌体的安全性及有效性，争取早日将其大规模应用于屠宰场沙门菌的防控。

总而言之，在生猪屠宰过程中，避免生猪之间的交叉污染并结合有效的消毒及清洁手段可有效地防止沙门菌污染，对禁食、运输和洗涤条件严格评估可避免屠宰前生猪间的交叉污染。最重要的是对屠宰操作的标准化培训和严格执行，是实现控制沙门菌污染的重要保证。

4 展望

屠宰和加工环节交叉污染现象较为普遍，加工装备设施、加工媒介、加工过程、健康猪和病猪交叉接触等造成严重的沙门菌污染，快速准确地检测沙门菌对食品安全及食源性疾病的诊断至关重要。全基因组测序(WGS)正迅速成为沙门菌分型的首选方法和金标准，未来将会全面代替传统的分子分型方法。现阶段，生猪屠宰场多使用消毒剂作为防控手段，由于消毒剂种类繁多，对特定屠宰场进行防控需要对各种消毒剂进行评估才能得到最佳消毒剂及消毒措施，对于开发新型手段代替消毒剂用于屠宰场防控值得期待。