伪狂犬病病毒US3基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶功能的研究进展

郭仕琦，许梦微，王志胜，何青，王继春，张传健*

(1. 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏 南京 210014；2. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；4. 常州同泰生物药业科技有限公司，江苏 常州 213136)

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属,是一种双链DNA病毒，大小约为150 kb[1]。伪狂犬病由PRV感染多种家畜和野生动物引起，是一种急性、可垂直传播的传染病，临床症状主要表现为发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎[2-3]。猪是PRV的主要自然宿主，成年猪群感染后表现为隐性感染和生殖系统症状，妊娠母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎等，公猪则表现为睾丸炎，仔猪表现为发热、神经症状以及高死亡率，给养猪业带来巨大的经济损失，是危害全球养猪业的主要传染病之一[4-5]。2011年以来，一种PRV变异株在我国猪群中暴发，研究发现其致病力显著增强，甚至引起成年猪死亡[6]。应用变异株同源病毒研发的基因缺失疫苗(缺失gE/gI、gE/TK、gI/TK等)虽可提供有效保护力[7-9]，但对新生仔猪的安全性还存在隐患[8]，说明存在其他毒力基因的病毒毒力。

US3基因是PRV的重要毒力基因，其开放阅读框长度为1 002～1 170 bp，编码334～390个氨基酸的蛋白丝/苏氨酸激酶，该蛋白在α疱疹病毒中高度保守[10]，具有磷酸化的活性，通过磷酸化发挥相应的功能[11]。PRV US3基因编码蛋白为多功能蛋白，可以分为两个亚型(US3a、US3b)，它们的大小、丰度和细胞内定位不同。较大亚型US3a的分子量为53 kDa，US3b分子量为41 kDa。由于US3基因编码蛋白分子较大，超过了被动扩散的限制，所以US3主要通过主动运输穿梭于细胞核质之间。在感染细胞中主要以US3b的形式存在。相较于US3b，US3a在其N-末端有额外的51个氨基酸。在US3a感染细胞中，US3a主要位于线粒体中，可分布在核膜和质膜之中。近年来研究发现，US3基因编码蛋白在病毒的扩散和侵入过程中起重要作用，此外还参与PRV逃避宿主免疫清除、抑制病毒引起的细胞凋亡，促病毒粒子出细胞核，调动感染细胞肌动蛋白骨架重排，诱导宿主细胞形态改变进而增强PRV在细胞中的感染能力。本文对US3基因编码蛋白在感染细胞中发挥的作用进行了综述。

1 US3影响病毒毒力

宿主的神经系统是PRV复制的主要靶点，通过研究PRV感染宿主中神经细胞的变化可解析病毒对神经系统的侵害。Olsen等[12]通过隔离培养体系，探究US3编码蛋白对PRV在神经元中的复制以及对啮齿动物毒力的影响。研究发现，US3突变株在神经元中的毒力较野生毒株减少了约10倍。此外，US3突变株接种大鼠临床表现症状为迟发型，随着时间的推移症状不断加重，最终接近野生毒株感染症状。

本研究团队近来研究发现，US3基因失活株相较于亲本毒株(LD50=10-3.26/0.2 mL)，US3基因失活株攻毒小鼠全部存活(初始滴度均为106TCID50/mL的亲本毒株和US3基因失活株，10倍系列稀释至10-5，取10-2～10-5进行攻毒)，表明US3基因失活可降低PRV对小鼠的致病性[13]。Kimman等[14]研究了PRV US3缺失株对猪的致病性，发现US3缺失致使PRV对猪的致病性降低。接种缺失株的10周龄生长猪相较于亲本毒株组，发热期缩短，排毒量减少；相较于阴性对照组，体重无显著差异。接种缺失株的3周龄仔猪仅出现2～4 d发热期，相较于阴性对照组，食欲和体重无显著差异。以上研究表明，US3在病毒感染宿主的过程中起重要作用，其突变会造成病毒毒力下降，进而导致病毒对宿主致病力减弱，这为PRV基因工程活疫苗的开发提供新的缺失靶点。

2 US3引起宿主免疫抑制

PRV可在猪体形成潜伏感染，引起免疫抑制，从而减少被清除概率，增加复制和传播机率[15]。自然杀伤(natural killer，NK)细胞可清除体内异常细胞，是一种宿主细胞自我保护的正常反应。CD300a是一种高度保守的抑制性NK细胞受体，可识别细胞表面暴露的氨基磷脂，如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，通过与配体的相互作用，抑制NK细胞的溶解活性。Grauwet等[16]研究表明，PRV US3能够激发CD300a受体与感染细胞表面的氨基磷脂结合，从而阻止感染细胞被NK细胞裂解。近来研究发现，US3通过降解Bcl-2相关转录因子1抑制Ⅰ型IFN反应，这在一定程度上促进PRV形成持续性感染[17]。

此外，许多疱疹病毒可通过干扰主要组织相容性复合物Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)介导的抗原递呈途径，避免或延迟CD8+ T细胞的清除作用，进而引起免疫抑制。Deruelle等[18]发现，PRV US3介导细胞表面MHC-Ⅰ下调机制呈细胞依赖性。US3可影响ST细胞表面MHC-Ⅰ表达，但是在PK-15和猪肺泡巨噬细胞中，US3对MHC-Ⅰ表达无显著影响。进一步研究发现，PRV感染ST细胞过程中，US3介导细胞表面MHC-Ⅰ的下调，取决于US3基因编码的激酶活性，用US3构建的真核表达质粒，对ST细胞表面MHC-Ⅰ的表达无显著影响。可能由于US3磷酸化的其他病毒蛋白参与，降低了PRV感染ST细胞表面MHC-Ⅰ的表达，因此，解析US3在ST细胞中介导的MHC-Ⅰ下调的机制具有重要意义。

此外，参与MHC-Ⅰ介导的抗原递呈途径的不同蛋白(抗原递呈通路分子和MHC-Ⅰ)的磷酸化，可能影响细胞表面MHC-Ⅰ的表达和抗原递呈。本团队最近研究也发现，US3抑制PRV变异株感染猪睾丸(swine testis，ST)细胞早期MHC-Ⅰ的mRNA转录[13]。以上结果表明，US3对特异性免疫和非特异性免疫均有抑制作用，这在一定程度上解释了US3缺失降低PRV对宿主的致病性。

3 US3抑制病毒介导的细胞凋亡

细胞凋亡是细胞的一种自我保护机制，是清除体内感染细胞的一种程序化反应，可限制病毒的复制和传播。US3是PRV中唯一具有抗凋亡活性的基因。PRV US3基因编码的两种蛋白亚型(US3a、US3b)，均可抑制PRV引起的细胞凋亡。Geenen等[19]研究表明，PRV感染可诱导细胞凋亡，US3a和US3b可在病毒复制晚期抑制PRV引起的细胞凋亡，亦可抑制山梨醇等外源诱导凋亡剂引起的细胞凋亡。相较于US3b，US3a抗凋亡效率更高。另有研究发现，US3基因编码的激酶活性，通过激活Bad蛋白磷酸化或PI3-K/AKT和NF-κB途径抑制PRV感染细胞凋亡[20-21]。以上研究表明，US3抑制病毒介导的细胞凋亡依赖于其激酶活性，然而US3基因编码的蛋白激酶对于PRV与宿主相互作用的调节方式和过程还需进一步研究。

4 US3影响病毒粒子在核质中的运输

由于US3编码蛋白分子较大，超过了被动扩散的限制，所以US3主要通过主动运输穿梭于细胞核质之间，US3基因突变影响PRV在核质中的运输[22-23]。Wagenaar等[24]研究发现，US3基因突变株在核膜外的跨膜转运功能受损，病毒核衣壳初始物在核膜周围聚集，核衣壳的进一步包裹和成熟受到影响，此研究表明US3参与病毒粒子向核外传递的过程。最近研究表明，US3a失活不影响病毒复制，US3b和US3编码的完整激酶活性影响病毒粒子向核外传递[25-27]。通过qPCR检测发现，与野毒株相比，US3缺失株DNA到达细胞核的效率显著下降，表明US3在将病毒基因组传递到细胞核的过程中发挥了重要作用[28]。

5 US3协助PRV通过呼吸道基底膜

基底膜位于上皮细胞和固有层之间，是不同α疱疹病毒早期需要穿透的重要屏障[29-32]。研究表明，US3编码蛋白在PRV侵入基底膜过程中发挥关键作用，通过研究猪鼻呼吸黏膜的离体系统发现，相比于亲本毒株，US3基因缺失株在黏膜上皮中的扩散减少，且无法破坏基底膜。添加RhoA信号通路抑制剂可促进US3基因缺失株穿过基底膜，而对野毒株和复苏株穿过效率无显著影响，表明US3通过Rho-GTPase信号通路介导PRV通过基底膜，进而增强病毒在细胞间的传播[25]。

6 US3介导细胞骨架重组

肌动蛋白是构成细胞骨架的重要部分，肌动蛋白损伤可增加病毒感染。研究表明多种疱疹病毒(包括PRV)可破坏细胞中的肌动蛋白。一些保守的α疱疹病毒US3能引起细胞肌动蛋白骨架发生变化，其中肌动蛋白应力纤维的断裂和突起的形成都可增加病毒的传播。疱疹病毒US3可在细胞核和细胞质中来回穿梭，致使US3基因编码蛋白既能单独识别细胞核或细胞质中的底物，又能识别在细胞核质中移动的底物，进而介导US3调控细胞骨架重排[33]。研究发现，PRV野生毒株和US3基因缺失株感染后，细胞内的肌动蛋白水平存在显著差异[18]。此外，US3基因缺失株及激酶失活的US3突变株随着病毒浓度的增加，肌动蛋白水平无显著差异，此研究提示，US3可能导致感染细胞中肌动蛋白的分解。在SK-6细胞上接种PRV野生毒株和US3缺失株后，野生毒株感染细胞后肌动蛋白应力纤维的分解水平显著高于US3缺失株，表明PRV US3基因编码的蛋白参与感染细胞肌动蛋白应力纤维的分解[26]。

在Rho-GTPase信号通路中，RhoA、Rac1和Cdc42参与可调节肌动蛋白细胞骨架。RhoA GTPase的激活，可以介导肌动蛋白应力纤维的形成，Rac1 GTPase和Cdc42 GTPase与细胞突起的形成有关，Rac1/Cdc42 GTPase信号通路与RhoA GTPase信号相互拮抗。US3编码蛋白的表达导致RhoA 188位丝氨酸磷酸化从而抑制了RhoA活性，引起细胞骨架的重组，非磷酸化RhoA突变体的表达，干扰US3诱导细胞骨架的重组。细胞蛋白激酶A被抑制后，US3编码蛋白诱导RhoA188位丝氨酸磷酸化的作用减弱，表明US3编码的蛋白，通过细胞蛋白激酶A依赖的RhoA 188位丝氨酸磷酸化，介导细胞骨架重组[27-28]。

Cofilin属于ADE(actin depolymeriz-ing factor)蛋白家族，是肌动蛋白动力学中的核心分子，通过3位丝氨酸残基的去磷酸化和磷酸化，调控肌动蛋白动力学。US3可通过诱导Cofilin蛋白去磷酸化引起细胞肌动蛋白骨架重组[34]。研究发现野生毒株和US3基因拯救毒株感染ST细胞，导致Cofilin 3位丝氨酸残基磷酸化降低，而PRV US3缺失株与阴性对照相比，细胞中Cofilin 3位丝氨酸残基磷酸化水平反而有增加的趋势(无显著差异)，表明US3可抑制Cofilin的磷酸化。US3编码的蛋白激酶失活的PRV毒株，没有抑制细胞内的Cofilin水平，表明抑制Cofilin的磷酸化依赖于US3编码的激酶活性[35]。

以上研究表明，PRV US3基因编码的激酶介导细胞骨架重组，进而增加病毒扩散，这种扩散方式可为PRV病毒感染所引起的疾病的预防与治疗提供新的思路，然而具体的分子机制需要进一步研究。

7 结论

US3编码的蛋白在PRV感染宿主过程中发挥着重要作用。US3编码的蛋白可介导肌动蛋白骨架的重排及诱导宿主细胞形态改变，从而增强病毒在细胞间的传播，亦可在病毒神经感染中和跨膜转运中影响病毒的毒力，同时可抑制细胞凋亡及引起宿主免疫抑制，为病毒的复制提供了条件。PRV US3编码的两个蛋白亚型(US3a、US3b)均可抑制病毒介导的细胞凋亡，但由于二者在细胞中定位的不同导致其抑制凋亡的效率存在差异。US3介导MHC-Ⅰ下调是细胞依赖性的，具体的作用机制需要进一步研究。此外，US3编码的蛋白激酶可介导宿主细胞肌动蛋白骨架的重排，影响病毒粒子在核质中的运输。将来的研究还需明确US3a、US3b和US3编码的蛋白激酶所介导的其他功能。本综述为PRV的致病机制的研究提供了参考，同时为PRV基因缺失疫苗构建提供了新的缺失靶点。