DExD/H-box家族RNA解旋酶介导的宿主-病毒相互作用

金春梅，于龙政，李太元，李艳茹 (延边大学 农学院，吉林 延吉133400)

DExD/H-box蛋白是SF2解旋酶超家族的主要成员，普遍存在于真核生物、细菌与古生菌中。其具有结合核苷酸、RNA及蛋白质的能力，能够利用水解ATP产生的能量参与mRNA前体加工、翻译起始、mRNA转运、核糖体生成、RNA降解等生物过程[1]。DExD/H-box解旋酶可以在不涉及易位过程的情况下有效地分离短RNA双链，这是多数DExD/H-box蛋白发挥解旋酶活性的基础。此外，DExD/H-box解旋酶能够定位到对应生理底物上，激活底物活性，促进RNA折叠和重排，加速RNA-蛋白质复合物重塑[1-2]。

DExD/H-box解旋酶包含8～9个保守基序(基序Q、基序Ⅰ、基序Ⅰa、基序Ⅰb、基序Ⅱ、基序Ⅲ、基序Ⅳ、基序Ⅴ、基序Ⅵ)，分别参与ATP结合、ATP水解、核酸结合和RNA解离[3]。这些保守基序包含在一个由2个柔性连接区连接的RecA样球状结构域组成的结构折叠中，这种结构折叠促进了与解旋酶活性相关的运动蛋白的功能。除了保守的功能核心外，大多数DExD/H-box解旋酶还包含可变的N-末端和C-末端延伸区域。这些延伸区可以调节酶活性，或者作为蛋白质相互作用的位点[4]。越来越多的研究表明，与免疫应答反应相关的DExD/H-box解旋酶在机体应对抗病毒感染的过程中发挥了重要作用。DExD/H-box解旋酶可以作为病毒核酸感受器，促进免疫反应下游信号转导，进而调节宿主抗病毒免疫[5-12]。本文将针对DExD/H-box解旋酶介导的宿主-病毒相互作用的最新研究进展进行综述。

1 DExD/H-box蛋白具有独特的RNA解旋酶活性

DExD/H-box蛋白的核心性序列与其他RNA和DNA解旋酶家族相似，核心序列能够有效地作用于短dsRNA或RNA-DNA杂交双链，通过水解ATP供给能量解开螺旋链。这些核心序列是DExD/H-box蛋白多种功能的基础，特别是涉及RNA结构变化的功能。尽管DExD/H-box蛋白的核心序列与传统解旋酶相似，但是该酶的解旋机制与传统的解旋酶不同。

1.1 解旋酶的效率随螺旋长度或稳定性的增加而下降传统解旋酶在解旋过程中，首先与双链的一端结合，然后利用ATP结合和水解的能量沿一条链进行定向移动或转运。大多数SF1和SF2解旋酶沿3'→5'方向移位，少数解旋酶向3'端移动分离双链。解旋酶在易位时紧紧结合其中一条链，导致另一条链移位。ATP水解、移位和链置换反复循环进行，最终导致螺旋完全解离。在每个循环中，解旋酶过早地从链上解离或突然结束解离反应的可能性极低，继续前进而不是解离的特性决定了解旋酶进行反应的能力，能力越强的解旋酶继续移位的可能性就越强[13]。研究人员通过评价成功解离事件的比例是如何随着螺旋长度的增加而降低的，进而评价解旋酶的解旋能力。以这种方式进行评估时，DExD/H-box蛋白的解旋能力较差。评价解旋酶能力通常需要测量数百或数千个碱基对，但是，对于DExD/H-box蛋白而言，当螺旋长度超过10～15 bp时，DExD/H-box蛋白就失去了解旋能力，当螺旋长度超过20～25 bp时，检测不到解离现象。DExD/H-box蛋白有效解离的双链长度较短，单个蛋白质单体可以与大部分双链结合。因此，DExD/H-box蛋白可能根本不需要任何移位过程就可以完成双链解旋[14]；此外，DExD/H-box蛋白的解旋效率主要依赖于螺旋的稳定性，而不仅仅依赖于螺旋的长度，但当DExD/H-box蛋白遇到更稳定的结构时，其移动速度会更慢。例如：真核蛋白翻译起始因子eIF4A(eukaryotic translation initiation factor 4A)是最早被发现的DEAD盒(DEAD-box)RNA解旋酶(RNA helicase)超家族成员，其在翻译过程中与核糖体、tRNA、mRNA相互作用，使得蛋白翻译有条不紊的进行，进而维持细胞正常的生命活动。eIF4A可以很容易解开某些短双链，但对于富含G-C对的双链来说解旋效率要低得多。

1.2 DExD/H-box蛋白通过延伸增强解离能力大多数RNA解旋酶都通过识别单链结构，在RNA复制过程中催化RNA解旋。RNA延伸可以提供一个与解旋酶相互作用的初始位点，解旋酶可以从这个位点开始易位到螺旋中。延伸部分需要具有一定的极性，以便定向移位将解旋酶核心移动到螺旋中，而不是移动到延伸部分的自由端。大多数解旋酶沿3'→5'方向移位，它们要求延伸部分包括一个自由的3'端。DExD/H-box蛋白与大多数SF1和SF2解旋酶截然不同，一些DExD/H-box蛋白分离钝端螺旋链与分离相同的带延伸的螺旋同样有效。DExD/H-box蛋白可以通过接触双链区域来启动解离，解离可以在双链内部开始。从双链内部开始解离的机制对于解离较长双链是不可能成功的，因此，许多DExD/H-box蛋白通过延伸来增强解离能力。但是，与传统解旋酶不同，无论极性如何，延伸都有利于解旋[15]。这种非极性激活与传统解旋酶需要定向移位的机制不同。

1.3 DExD/H-box蛋白识别RNA或RNA-protein的分子基础DExD/H-box家族蛋白是一类RNA解旋酶，广泛存在于真核生物和大多数原核生物中。该家族蛋白通常含有8～9个保守的基序，分别为基序Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ与Q，其中基序Q为DEAD-box亚家族所特有。多数DExD/H-box蛋白通过解旋酶核心内特定的环(或表面)或者附近的辅助结构域低特异性或无特异性地与特定的RNA或RNA-protein(RNPs)的螺旋延伸结合并发生相互作用，进而发挥特殊的功能。近年来，通过对一系列解旋酶或与ssRNA结合的核苷酸类似物的晶体结构进行分析，研究人员解析了DExD/H-box蛋白分离RNA链的分子机制。DExD/H-box与RNA或RNPs结合时，结合配体与解旋酶核心的所有基序排列在2个域之间的界面上，并形成RNA和腺苷酸结合位点。结合的RNA位于一个跨越2个结构域的基本缝隙中，包含来自结构域1以及结构域2的部分基序[14]。

2 DExD/H-box蛋白参与调节宿主免疫应答

许多DExD/H-box解旋酶与抗病毒免疫有关，视黄酸诱导基因蛋白-I(RIG-I)样解旋酶、黑色素瘤分化相关抗原5(MDA5)和遗传学生理学实验室蛋白2(LGP2)是重要的RNA病毒胞内模式识别受体[12]。RIG样解旋酶或其他抗病毒模式识别受体识别病毒核酸后诱导Ⅰ型干扰素(IFN)和促炎细胞因子产生[11]。最近，DExD/H-box解旋酶被证实具有病毒核酸的胞液传感器功能。然而，也有研究表明，有一些DExD/H-box解旋酶可能在模式识别受体信号通路的下游发挥了更多功能，如作为信号适配器或转录调节因子。此外，许多DExD/H-box解旋酶参与了不同病毒复制，是病毒复制必须的宿主因子，病毒为了自身复制“劫持”了DExD/H-box蛋白的RNA解旋酶活性。因此，DExD/H-box解旋酶可能是病毒和宿主免系统之间“军备竞赛”的竞争目标。

2.1 DExD/H-box蛋白作为天然免疫的正调控因子RIG-I是DExD/H-box RNA解旋酶家族的成员，能够识别细胞质中的病毒RNA，进而激活线粒体抗病毒信号蛋白分子(IPS-1)形成类似朊病毒的聚集体， 进一步激活下游信号通路，最终激活干扰素调节因子3(IRF3)和核因子-κB(NF-κB)并诱导细胞表达IFN-β[16-17]。细胞内通常含有微量的RIG-I，因此，在感染的最初阶段，其他RNA结合蛋白可能参与将病毒RNA传递到线粒体抗病毒信号途径中[18]。OSHIUMI等[19]用酵母双杂交技术发现了与人IPS-1偶联的DEAD BOX(Asp-Glu-Ala-Asp)解旋酶DDX3(DEAD/H BOX3)。DDX3可以与病毒RNA结合，进一步使其与IPS-1复合物结合。与RIG-I不同，DDX3在细胞中呈组成型表达的状态，部分DDX3片段与IPS-1共存于线粒体周围。DDX3 C-末端区域(第622～662位氨基酸)直接与IPS-1的半胱天冬酶招募结构域(CARD)结合，整个DDX3蛋白也与RIG-I受体(RLR)相关。DDX3能够协助IPS-1增强IFN-β启动子的激活，通过小干扰RNA(siRNA)下调DDX3表达导致IFN-β表达水平降低。转染TANK结合激酶1(TBK1)或I-kappa-B激酶-ε(IKKε)后DDX3诱导的IFN-β启动子活性仅略微增强。过表达DDX3增强了病毒介导的IFN-β诱导表达和宿主细胞对病毒感染的保护作用。因此，DDX3是一种抗病毒IPS-1的增强剂。

NF-κB在促进炎症和抵抗损伤治疗方面发挥着重要作用。SZYMURA等[11]通过筛选鉴定出与κB DNA探针发生作用的细胞因子-DexD/H-box RNA解旋酶(DDX39B)，并证实DDX39B通过与模式识别受体(PRR)LGP2相互作用抑制p65磷酸化进而抑制NF-κB的活性[11，20]。DDX39B蛋白丰度受到位点特异性SUMO化的调节，从而促进其泛素化和降解[21]。全基因组分析表明，DDX39B通常并不抑制干扰素刺激的基因表达，而是减弱与细胞外基质、细胞迁移和血管生成相关因子的表达。因此，DDX39B是一种RNA结合蛋白，可以阻断一部分炎症反应，在mRNA剪接和核输出过程中发挥重要功能。

2.2 DExD/H-box蛋白作为天然免疫的负调控因子TBK1是Ⅰ型IFN合成过程中最为关键的蛋白激酶，在抗病毒固有免疫应答中发挥重要作用。TBK1和IKKε能同时激活转录因子IRF3、IRF7和NF-κB，进而促进Ⅰ型IFN的表达[22]。DExD/H-box解旋酶是识别病毒核酸的关键受体，它们调节RIG-I样受体介导的Ⅰ型IFN的产生。ZHANG等[23]证明DExD/H-box RNA解旋酶19(DDX1)是Ⅰ型IFN产生的负调控因子。过表达DDX19抑制了聚poly(I：C)和仙台病毒诱导的Ⅰ型IFN的产生，下调表达DDX19则促进了Ⅰ型IFN的产生。DDX19能够影响TBK1或IKKε与IRF3之间的相互作用，抑制TBK1和IKKε激酶介导的IRF3磷酸化。此外，DDX19还招募了Lamtor2，形成了TBK1-IKKε-Lamtor2-DDX19-IRF3复合物，促进TBK1和IKKε的降解进而抑制IFN产生。小鼠敲除DDX19基因后，产生的Ⅰ型IFN增加，抑制了脑心肌炎病毒的复制。因此，DDX19负调控RLR介导的Ⅰ型IFN产生。

病毒RNA是RNA病毒在宿主细胞复制过程中产生的，可被RIG-I样受体识别，激活相关信号通路，合成Ⅰ型IFN，并以旁分泌或自分泌的方式转录产生大量的IFN刺激基因(ISGs)[24-25]。然而，不受控制的先天免疫反应也可能导致有害宿主的炎症反应。因此，维持宿主先天免疫的动态平衡至关重要[26]。RIG-I样受体信号通路受到正负调控因子的严格调控，Fas相关死亡结构域(FADD)和受体相互作用蛋白1(RIP1)促进信号转导，是凋亡和炎症信号通路的关键角色。DDX24是一种解旋酶，具有负调控ISG的作用。DDX24在RLR依赖的信号转导中发挥负调控作用，是调控天然免疫的重要基因。DDX24在宿主细胞中劫持接头蛋白FADD和RIP1，抑制病毒RNA依赖的IFN的产生，并促进RNA病毒在某些细胞中的复制。DDX24缺陷的小鼠胚胎早期致死，这表明该解旋酶除了调节RLR信号外，可能还发挥其他重要作用。此外，FENG等[5]报道DDX25是Ⅰ型IFN通路的负调控因子，可促进RNA病毒感染。在登革热病毒(DENV)感染初期，细胞内DDX25 mRNA和蛋白的水平均上调。在DENV感染期间，沉默DDX25后细胞内病毒载量显著降低，而DDX25过表达细胞内病毒载量显著升高。与此同时，在病毒感染过程中，DDX25 siRNA处理的细胞中Ⅰ型IFN的表达水平升高。DDX25转基因小鼠对致命性水疱性口炎病毒(VSV)感染的敏感性增加，病毒血症明显升高，而抗病毒细胞因子水平较低。DDX25调制RIG-I信号通路和阻塞IFN-β生产，阻断IRF3和NF-κB激活。因此，DDX25是一种新的IFN通路负调控因子，有利于RNA病毒的感染。

2.3 DExD/H-box蛋白作为细胞内抗病毒“哨兵”宿主细胞识别病毒DNA是其启动抗病毒反应的关键。ZHANG等[27]证明DDX41是髓系树突状细胞(mDCs)内的DNA传感器，DDX41是DExD/H-box解旋酶家族的一员。RNA干扰敲低DDX41表达，阻断了mDCs表达Ⅰ型IFN和细胞因子的能力。过表达DDX41和接头分子STING在促进IFN-β启动子活性方面具有协同作用。DDX41结合了病毒DNA和STING，并与STING一起定位在胞浆中。下调表达DDX41阻断了TBK1和转录因子NF-κB与IRF3的激活。因此，DDX41是一种附加的DNA传感器，其依靠STING检测病毒DNA。

OSHIUMI等[28]证明DDX60是细胞质抗病毒天然免疫反应的哨兵。RIG-I介导的Ⅰ型IFN的产生和核酸酶介导的病毒RNA降解是抗病毒先天免疫反应所必需的[29-30]。DDX60是IFN诱导的胞质解旋酶，DDX60作为RIG-I激活的哨兵以配体特异性的方式作用于RIG-I的上游，激活RIG-I信号。DDX60基因敲除可减弱RIG-I信号，并显著减少体内Ⅰ型IFN的产生。OSHIUMI等[28]还发现DDX60参与了非RIG-I依赖的病毒RNA的降解。丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和其他热病毒可以激活表皮生长因子受体(EGFR)[31]，这些病毒通过EGFR诱导DDX60磷酸化，导致DDX60抗病毒活性减弱。因此，DDX60是胞质抗病毒反应的哨兵，但是这种反应可被EGFR的激活所抵消。

LU等[32]发现DHX15是髓系树突状细胞中重要的RNA感受器。阻断DHX15表达可有效降低髓系树突状细胞产生IFN-β、IL-6和TNF-α的能力。DHX15能与poly I：C特异性结合，但不能与聚脱氧鸟苷酸-脱氧胞苷酸(PolydG：dC)特异性结合。DHX15以MAVS依赖的方式诱导Ⅰ型IFN和促炎细胞因子的产生，以应答dsRNA和RNA病毒感染。在RNA呼肠孤病毒感染过程中，DHX15还需要激活IRF3磷酸化、NF-κB和MAPK信号。PATTABHI等[33]证实DHX15是RLR信号的协同受体，可促进抗RNA病毒感染的抗病毒防御。DHX15的敲除增加了宿主对不同种属RNA病毒感染的敏感性，包括副黏病毒科、横纹病毒科和小核糖核酸病毒科。DHX15过表达增强了RNA病毒感染后的先天免疫信号。DHX15通过其氨基末端与RIG-I半胱氨酸蛋白酶和招募结构域相关联形成复合物，该复合物在病毒感染时被招募到MAVS中。

2.4 病毒利用宿主DExD/H-box蛋白干扰宿主的免疫反应RNA解旋酶除了在抗病毒免疫中发挥作用外，还被病毒主动招募以促进其复制周期。虽然原核和真核基因组都含有RNA解旋酶基因，但许多病毒不能编码RNA解旋酶[34]。病毒在很大程度上依赖宿主RNA解旋酶重塑基因组RNA和复制中间产物，或者将其基因组RNA包装成病毒粒子[35]。一些DExD/H-box解旋酶似乎具有双重功能，既是天然免疫介质，又是病毒复制的辅助因子。

DDX3在抗病毒天然免疫中的功能，它可以抑制Ⅰ型IFN的产生。但是，DDX3也是几种病毒复制的重要宿主因子，尤其是获得性免疫缺陷综合征病毒(HIV)和丙型肝炎病毒[36-37]。HIV 能够产生一种叫做Rev的蛋白，用于从细胞核中转运长的、未剪辑的RNA。这些病毒RNA含有能够被Rev识别的REV反应元件(RRE)，REV富含亮氨酸的核输出信号(NES)，并与核转运信号蛋白1(CRM1)结合，组装形成REV-RRE-RNA复合物，介导含有NES的蛋白的输出。但是Rev和CRM1不足以完成复杂的RNA剪切过程。宿主细胞核的过程中利用了DDX3。与DDX3类似，DDX1已被证明有助于REV依赖的HIV RNA的核输出过程[38]。DDX1在REV-RRE-RNA复合物的组装中发挥作用，可能为它们通过CRM1途径有效输出做好准备。以上研究表明DExD/H-box解旋酶似乎位于病毒和宿主免疫系统之间进化军备竞赛的前线。

3 总结与展望

近年来，虽然DExD/H-box解旋酶介导的宿主-病毒相互作用的研究取得了令人瞩目的进展，但仍存在许多未知的环节。例如：如果“感知”病毒核酸是DExD/H-box解旋酶的主要作用，它们如何准确地区分细胞核酸和病毒核酸；DExD/H-box解旋酶是否在抗病毒先天免疫过程中作为辅助受体或具有额外的下游作用；DExD/H-box解旋酶与病毒RNA相互作用时，它们的亚细胞定位发生了变化，即从细胞核定位到细胞质的病毒复制位点，定位的变化是否是导致其功能发生变化的关键因素；在细胞质内，DExD/H-box解旋酶是否进化为参与抗病毒免疫的解旋酶，同时扰乱抗病毒免疫反应。因此，有必要对DExD/H-box解旋酶进行系统的研究，进一步分析其基因的功能与作用机制，明确DExD/H-box解旋酶在病毒感染过程中的生物学功能，从而为预防和治疗病毒感染提供潜在的药物靶点。