miR-16联合Cripto-1、ANXA7诊断胃癌及其淋巴结转移的临床价值研究

谢 宇，李会颖，林永娟，孙 岩

1.南京大学医学院附属鼓楼医院老年医学科；江苏南京 210008；2.江苏省肿瘤医院内科，江苏南京 210009

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，我国是胃癌的高发国家，其每年新发病例数占全球的40%以上[1]。多数胃癌患者在发现时已处于癌症中晚期，导致患者临床预后不佳[2]。目前一致认为，早期发现胃癌并采用合理的方案进行干预治疗，有助于提高患者生存率，并改善预后[3]。微小核糖核酸(miRNA)是可调控基因转录和表达的非编码RNA，有研究结果证实其在肿瘤的凋亡、增殖、转移和侵袭过程中扮演十分重要的角色[4]。研究表明，miR-16在胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等患者体内水平异常，其可能在恶性肿瘤的诊断和评估中起重要作用[5]。畸胎瘤衍生生长因子(Cripto-1)是可有效维持胚胎干细胞和多能性干细胞的标志物，有学者指出，在多种肿瘤组织中Cripto-1表达处于异常活跃状态，且在癌变前其水平即会出现明显升高[6]。膜联蛋白A7(ANXA7)是近年来被广泛研究的热点，具有调节细胞分化、膜转运、凋亡、钙离子信号及生长等生物学功能，且在多种肿瘤中均呈现明显异常表达状态[7]。目前，miR-16联合Cripto-1、ANXA7在胃癌早期诊断中的应用报道较少，因而本研究对南京大学医学院附属鼓楼医院收治的胃癌患者进行分析，探讨miR-16联合Cripto-1、ANXA7诊断胃癌及其淋巴结转移的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2019年9月于南京大学医学院附属鼓楼医院内科治疗的胃部疾病患者546例作为研究对象，根据是否符合胃癌诊断标准[1]分为胃癌组(121例)和非胃癌组(425例)。其中胃癌组患者根据胃癌进展情况分为早期胃癌组(44例)和进展期胃癌组(77例)；根据淋巴结是否转移分为淋巴结转移组(71例)和无淋巴结转移组(50例)。非胃癌组中男261例，女164例；平均年龄(67.38±8.32)岁；胃炎206例、胃溃疡182、其他37例。选择同期该院体检健康者50例作为对照组，其中男29例、女21例，平均年龄(68.03±6.31)岁。各组受试者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。胃癌组纳入标准：(1)组织病理学检查确诊为胃癌；(2)入组前未接受化疗、放疗、免疫疗法治疗。排除标准：(1)合并严重肝、肾系统疾病；(2)合并其他结缔组织病；(3)精神异常无法配合本研究。

1.2方法 晨起空腹时抽取静脉血3 mL置于离心管中，2 500 r/min离心15 min，取上清液500 μL至小型离心管中保存，按照总RNA快速提取试剂盒说明书从中提取总RNA。采用实时荧光定量PCR检测血清miR-16水平，并以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-16水平，所用引物均购自南京金斯瑞生物科技有限公司。miR-16引物设计如下，上游:5′-ATC AAG CTT ATC AGA CAA GC-3′，下游:5′-ATG TGC CCG GTC AGA GGC-3′。采用酶联免疫吸附测定检测血清ANXA7、Cripto-1水平，试剂盒购自南京福麦斯生物科技有限公司。

2 结 果

2.1各组miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比较 胃癌组血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于对照组和非胃癌组(P<0.05)，见表1。

表1 各组miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比较

2.2不同胃癌亚组患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比较 进展期胃癌组血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于早期胃癌组(P<0.05)，淋巴结转移组血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于无淋巴结转移组(P<0.05)，见表2。

表2 不同胃癌亚组患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比较

2.3miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌的价值 miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌的最佳临界值分别为11.81、71.51 μg/L、2.26 μg/L，3项指标联合诊断胃癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.996，其灵敏度(95.04%)和特异度(97.26%)较高，见表3。

表3 miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌的价值

2.4miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌淋巴结转移的价值 miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌淋巴结转移的最佳临界值分别为18.95、78.93 μg/L、3.73 μg/L，3项指标联合诊断胃癌淋巴结转移的AUC为0.996，其灵敏度(97.18%)和特异度(96.00%)较高，见表4。

表4 miR-16、ANXA7、Cripto-1诊断胃癌淋巴结转移的价值

2.5血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平的相关性分析 胃癌患者血清miR-16水平与ANXA7、Cripto-1水平均呈正相关(r=0.465、0.519，均P<0.05)。

3 讨 论

胃癌是现阶段我国最为常见的消化系统恶性肿瘤，目前呈现明显的年轻化趋势，且临床发病率逐年升高。有研究指出，胃癌早期缺乏特异性的体征和症状，导致无法被及时发现，当患者出现临床表现进行诊治时，大多数患者已发展到进展期或发生远处转移，错失了最佳手术时机[8]。因而有学者指出对胃癌进行早期诊断和评估，并及时预测淋巴结转移对临床救治具有十分重要的意义[9]。胃癌的发生、发展、转归属于连续性、多阶段、多因素的病理过程，发病机制较为复杂，涉及原癌基因及抑癌基因的遗传学和表观遗传学变化，所以选择合适的生物学指标对胃癌进行判断，具有一定的理论依据[10]。

有研究表明，miR-16在多种恶性肿瘤患者体内均呈现异常表达状态，包括miR-16在内的多种miRNA具有评估恶性肿瘤患者转移、分期和预后的价值[11]。ANXA7在恶性胶质瘤、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞中均呈现明显的异常表达状态，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[12]。Cripto-1是从人类NTERA-2畸胎瘤cDNA中分离和克隆的表皮生长因子家族结构相关蛋白，在胚胎发育过程中起不可或缺的作用[13]，有效参与并调控肿瘤细胞上皮间质转化，促进肿瘤细胞转移和浸润[14]。本研究表明胃癌组患者血清ANXA7、miR-16、Cripto-1水平高于对照组及非胃癌组，有相关研究显示，在胃癌细胞中ANXA7蛋白定位于细胞质和细胞核，呈线网状或黄色颗粒分布，且其在胃癌细胞中的水平明显高于正常细胞[12-14]。进展期胃癌组血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于早期胃癌组。进一步分析显示，miR-16、ANXA7、Cripto-1这3项指标联合诊断胃癌的AUC为0.996，有较高的灵敏度和特异度，3项指标联合诊断胃癌淋巴结转移的AUC为0.996，也有较高的灵敏度和特异度。Pearson相关分析结果显示，胃癌患者血清miR-16水平与ANXA7、Cripto-1水平均呈正相关。此前，有相关报道也显示在胃癌组织中多种miRNA呈现明显的异常表达状态，且相关miRNA水平随淋巴结的转移而升高，因而推测miRNA可作为影响胃癌患者病情进展的独立危险因素[15]。Cripto-1可与膜相关磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1特异性结合，激活酪氨酸激酶，并活化Akt信号通路，具有促进细胞迁移、增殖和浸润的作用。此外，生长因子β配体还可与Cripto-1形成复合物，抑制转化生长因子-β信号传导，加速肿瘤细胞增殖。分析认为miR-16、ANXA7、Cripto-1相互影响，且可能随着患者病情进入进展期和淋巴结的转移，患者的肿瘤负荷增大，导致肿瘤组织释放大量与原癌基因作用的miRNA和蛋白质进入血液，引起各指标水平明显升高。3项指标联合应用可有效诊断胃癌及其淋巴结转移，可从多角度对患者体内肿瘤细胞的变化状态进行有效评估，所评估的结果相对更为精准。

综上所述，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7在胃癌患者中水平升高，且进展期患者和淋巴结转移患者的上述指标水平明显高于早期胃癌患者和无淋巴结转移患者，表明随着病情加重，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7水平升高，miR-16水平与Cripto-1、ANXA7水平呈正相关，3项指标联合应用可有效诊断胃癌及其淋巴结转移，具有较高的临床价值。