胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表达变化及其临床意义

王宁，于海，宋千，廉民学，鲍刚，何百祥

西安交通大学第一附属医院，西安710061

胶质瘤是中枢神经系统常见的肿瘤之一，以WHO 中枢神经系统肿瘤分类Ⅲ、Ⅳ级多见［1］。手术切除联合术后放化疗或免疫治疗是胶质瘤最常见的治疗手段，但其治疗后短期复发转移率高，患者预后较差，中位生存期一般不超过15个月［2-3］。胶质瘤的发病部位较为特殊，临床表现无特异性，CT、MRI 等影像学检查亦缺乏特征性，故其术前诊断困难。因此，寻找灵敏度高、特异度强的胶质瘤分子标志物对其早期诊断和靶向治疗具有重要意义。HOXA 反义转录物髓系异构体1（HOTAIRM1）是人类7 号染色体上的一种长链非编码RNA（lncRNA），虽然不编码蛋白质，但可通过调控基因的表达参与细胞转录和翻译过程，如通过上调内质网分子伴侣GRP78 表达，帮助蛋白正确折叠，从而促进细胞生存并抑制其凋亡［4］。有研究报道，lncRNA HOTAIRM1 表达失调可介导胃癌的发生、发展［5］。微小RNA（miRNA）是一类具有转录后调节活性的内源性小分子RNA，能够与靶基因mRNA 的3′端非编码区特异性结合，从而降解靶基因mRNA 或抑制其翻译，进而在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中发挥重要作用［6］。miR-129-5p 是miRNA 家族成员之一。有研究报道，子宫内膜癌、膀胱癌组织miR-129-5p 表达下调，且其表达变化与患者临床病理特征密切相关［7-8］。但目前关于lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p在胶质瘤组织中表达变化的报道较少。2014年5月—2017年5月，本研究观察了胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期西安交通大学第一附属医院收治的胶质瘤患者83例（观察组），均经术后组织病理学检查证实。纳入标准：①符合胶质瘤诊断标准；②首次确诊；③接受外科手术治疗，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④预计生存期超过6个月；⑤病历资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②伴有颅内其他疾病者；③合并心、肝、肾等重要脏器功能不全者；④妊娠期或哺乳期妇女。其中，男51 例、女32 例，年龄26～77（55.62 ± 8.23）岁，BMI 19～26（22.08 ± 2.12）kg/m2，合并高血压21 例、糖尿病18 例、高脂血症15例；肿瘤位置：颞部45例，额部38例；肿瘤直径：＜4 cm 39例，≥4 cm 44例；病理类型：星形细胞瘤49 例，胶质母细胞瘤34 例；WHO 分级：Ⅰ、Ⅱ级53例，Ⅲ、Ⅳ级30例。

同期选择因颅脑损伤在西安交通大学第一附属医院接受外科手术治疗者55例（对照组），手术切除组织经组织病理学检查证实为正常脑组织。其中，男34 例、女21 例，年龄25～78（53.49 ± 8.70）岁，BMI 19～25（22.34 ± 2.05）kg/m2，合并高血压13例、糖尿病11例、高脂血症8例。

两组性别、年龄、BMI、合并症等临床资料具有可比性。本研究经西安交通大学第一附属医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表达 检测采用RT-qPCR 法。取手术切除的胶质瘤组织和正常脑组织，液氮下研磨成粉末状，按TRIzol 说明提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，总RNA 的浓度和纯度合格。 按PrimeScipt RT Reagent Kit 说明将总RNA 逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR 扩增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。lncRNA HOTAIRM1上游引物：5"-CCCACCGTTCAATGAAAG-3"，下游引物5"-GTTTCAAACACCCACATTTC-3′；miR-129-5p上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG⁃GT-3"，下游引物5"-ATTCGCACTGGATACGACG⁃CAAGC-3"；U6 上游引物5"-GCACCGTCAAGGCT⁃GAGAAC-3"，下游引物5"-TGGTGAAGACGCCAGT⁃GGA-3"。PCR 扩增体系共20 μL：SYBR Premix Ex Tap Ⅱ9 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，无酶蒸馏水7.4 μL；反应条件：95 ℃变性60 s，95 ℃变性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s 共36 个循环。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT 法计算lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 胶质瘤患者术后采用门诊复查或电话形式定期随访。术后第1年每隔3个月随访1次，术后第2年每隔6个月随访1次，术后第3年随访1次，共随访3 年。终点事件为患者死亡或随访结束，统计患者生存时间。

1.4 统计学方法 采用SAS9.4统计软件。计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 积矩相关分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表达比较 观察组与对照组lncRNA HOTAIRM1 相对表达量分别为2.36 ± 0.19、1.12 ± 0.25，miR-129-5p 相对表达量分别为0.37±0.12、0.83±0.11。观察组lncRNA HOTAIRM1 相对表达量高于对照组，miR-129-5p 相对表达量低于对照组（t分别为33.046、22.785，P均＜0.05）。

2.2 胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1 表达与miR-129-5p表达的关系 Pearson积矩相关分析显示，胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1相对表达量与miR-129-5p相对表达量呈负相关关系（r=-0.726，P＜0.05）。

2.3 胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表达与患者临床病理特征的关系 分别以胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p相对表达量的中位数（1.93、0.45）为临界值，将患者分为lncRNA HOTAIRM1 低表达者40 例与lncRNA HOTAIRM1 高表达者43例、miR-129-5p低表达者46例与miR-129-5p高表达者37例。不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表达与胶质瘤患者临床病理特征的关系见表1。

2.4 胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表达与患者生存时间的关系 lncRNA HOTAIRM1高表达者累积生存时间为16.22（95%CI：14.06～18.38）个月，lncRNA HOTAIRM1 低表达者为20.91（95%CI：18.93～22.89）个月，lncRNA HOTAIRM1高表达者累积生存时间低于lncRNA HOTAIRM1 低表达者（χ2=10.836，P＜0.05）。miR-129-5p高表达者累积生存时间为23.07（95%CI：21.52～24.62）个月，miR-129-5p 低表达者为18.10（95%CI：15.36～19.85）个月，miR-129-5p高表达者累积生存时间高于miR-129-5p低表达者（χ2=12.015，P＜0.05）。见图1、2。

3 讨论

胶质瘤是临床常见的一种颅内原发性肿瘤，其发病率不断上升。随着现代医学技术的发展，胶质瘤的治疗手段不断优化和改进，但患者预后仍不理想，5 年生存率较低。胶质瘤的发病部位较为特殊，临床表现无特异性，CT、MRI 等影像学检查亦缺乏特征性，故其术前诊断困难。因此，寻找灵敏度高、特异度强的胶质瘤分子标志物对其早期诊断和靶向治疗具有重要意义。

有研究报道，胶质瘤发病与体内促癌基因激活和抑癌基因失活密切相关［9］。lncRNA 是一类内源性非编码RNA，可从多个层面参与细胞生物学功能调控。近年研究发现，lncRNA 还可作为促癌基因或抑癌基因参与多种恶性肿瘤的发生、发展。ZONG等［10］研究发现，胃癌细胞lncRNA H19 表达上调，其表达上调能够激活p53，从而促进胃癌细胞增殖并抑制其凋亡。ZHANG 等［11］研究报道，HOX 转录反义RNA 在结肠癌、乳腺癌、肝癌中异常表达，可通过招募Polycomb 抑制复合物2 至抑癌基因位置，从而抑制抑癌基因表达，进而促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡。HOTAIRM1是lncRNA家族成员之一，可介导多种恶性肿瘤的发生、发展。江梅等［12］研究报道，HOTAIRM1 在非实体瘤中发挥抑癌作用，可通过介导肿瘤增殖相关信号通路影响细胞增殖、分化，进而诱发急性髓系白血病。程磊等［13］研究报道，HOTAIRM1 表达失调可参与胶质瘤的发病过程，但该研究未探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。本研究结果发现，与对照组比较，观察组lncRNA HOTAIRM1 表达上调，提示lncRNA HOTAIRM1 能够参与胶质瘤的发生、发展，其作用机制可能是lncRNA HOTAIRM1 与Polycomb 特异性结合后抑制多梳抑制复合物2 和组蛋白去甲基化酶UTX/MLL 活性，通过调节染色质构象进而影响HOXA1 基因簇的转录活性，从而促进胶质瘤的发生、发展［14］。LI 等［15］研究表明，lncRNA HOTAIRM1特异性结合G9a、Zeste 基因增强子同源物2，通过影响H3K27、H3K9的去甲基化，降低DNA甲基化水平，最终促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。本研究结果还发现，肿瘤直径≥4 cm和WHO 分级Ⅲ、Ⅳ级的胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1 高表达的比例明显增加，且lncRNA HOTAIRM1 高表达者累积生存时间明显低于lncRNA HOTAIRM1 低表达者，提示lncRNA HOTAIRM1可作为评估胶质瘤患者病情进展和预后判断的生物标志物。

表1 不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表达与胶质瘤患者临床病理特征的关系［例（%）］

图1 胶质瘤组织不同lncRNA HOTAIRM1表达者生存曲线

图2 胶质瘤组织不同miR-129-5p表达者生存曲线

miR-129-5p 是miRNA 家族成员之一。有研究报道，miR-129-5p表达下调能够促进原发性肝癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤的发生、发展，并与肿瘤侵袭和转移密切相关［16-19］。本研究观察组miR-129-5p相对表达量明显低于对照组，即miR-129-5p 可能作为一种抑癌基因参与胶质瘤的发生。有研究认为，miR-129-5p 的直接调控靶基因之一为TGIF2，miR-129-5p表达下调减弱了mRNA转录后和蛋白翻译水平上对TGIF2 表达的抑制效应，而TGIF2 表达上调又能强化Wnt/β-catenin 信号通路，从而促进胶质瘤的发生、发展［20］。本研究结果还发现，肿瘤直径≥4 cm和WHO分级Ⅲ、Ⅳ级的胶质瘤组织miR-129-5p低表达的比例明显增加，并且miR-129-5p 低表达者累积生存时间明显低于miR-129-5p 高表达者，提示miR-129-5p可作为评估胶质瘤患者病情进展和预后判断的生物标志物。

本研究结果还发现，胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1相对表达量与miR-129-5p相对表达量呈负相关关系，推测lncRNA HOTAIRM1表达上调可能通过负调控miR-129-5p 导致其活性降低，进而使TGIF2表达上调，从而促进胶质瘤的发生、发展［16］。

综上所述，胶质瘤组织lncRNA HOTAIRM1 表达上调、miR-129-5p表达下调，二者表达变化与肿瘤直径、WHO 分级和患者预后密切相关。lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 有可能作为评估胶质瘤病情程度和预后判断的生物标志物。