Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法用于茶饮料抗氧化活性的评价

马 天 ,王静雨 ,张敏昕 ,张春发 ,张津津 ,马 莉,2*

(1.河北医科大学 公共卫生学院,石家庄 050017;2.河北省环境与人群健康重点实验室,石家庄 050017)

我国是产茶和饮茶大国,由茶叶开发出的茶饮料是重要的畅销饮料之一。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称,是茶叶中具有保健功能的主要成分,包括儿茶素类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类化合物等。没食子酸(GA,CAS 号:149-91-7)及7种儿茶素化合物[(－)-儿茶素(C,CAS 号:154-23-4)、(－)-表儿茶素(EC,CAS 号:490-46-0)、(－)-表没食子儿茶素(EGC,CAS 号:970-74-1)、(－)-表儿茶素没食子酸酯(ECG,CAS号:1257-08-5)、(－)-没食子儿茶素(GC,CAS 号:3371-27-5)、(－)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG,CAS 号:4233-96-9)、(－)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,CAS号:989-51-5)]占所有茶多酚总量的90%以上;其中,EGCG 约占50%,EGC 占约占20%,ECG 约占15%,EC 约占5%,它们是茶叶中的重要活性物质,清除自由基能力显著,具有优异的抗氧化能力[1-4]。

目前,体外抗氧化活性评价方法很多,主要包括2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除法[5-8]、邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法[9]和鲁米诺-过氧化氢化学发光法[10]等。DPPH 自由基清除法是基于测定褪色程度的变化来评价抗氧化活性的[5]。DPPH 会产生一种氮自由基,其醇溶液呈紫色,在517 nm 处有强吸收,当加入抗氧化剂时,抗氧化物中活性氢解离并与DPPH 自由基结合,DPPH 自由基被清除,且被清除的自由基越多,溶液颜色越浅,溶液的褪色程度与吸光度的变化成正比,可用自由基清除率为50%时对应的抗氧化剂浓度即IC50来准确评价抗氧化剂的抗氧化活性[7],活性物质的IC50越小,则抗氧化剂对DPPH 自由基的清除能力越强,抗氧化能力越强。邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法是通过测定化学发光强度的减弱程度来评价抗氧化活性的,邻苯三酚在碱性条件下会被氧化产生超氧阴离子自由基(O2－·),O2－·将与鲁米诺反应,产生含有一个电子的激发态中间产物,当这个中间产物返回基态时,会产生化学发光,而抗氧化剂能捕获O2－·,使产生的化学发光强度减弱。鲁米诺-过氧化氢化学发光法是通过测定化学发光强度的减弱程度来评价对过氧化氢中活性氧的清除能力的。在碱性条件下,过氧化氢-鲁米诺体系会产生化学发光,且这种化学发光强度与过氧化氢含量成正比,抗氧化剂通过清除过氧化氢而使化学发光强度下降。

三价银配合物[Ag(Ⅲ)]与鲁米诺组成的化学发光体系也可用于测定抗氧化剂,抗氧化剂可与Ag(Ⅲ)发生氧化还原反应,并使体系的化学发光强度增强,增强的程度与抗氧化剂含量在一定范围内成正比,已用于抗坏血酸[11]、多巴胺[12]、皮质醇[13]、青霉胺[14]等物质含量测定,但是用该方法评价茶饮料抗氧化活性的文章还未见报道。据此,本工作以Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法测定了茶叶中主要存在的没食子酸和7 种儿茶素化合物,并同DPPH 自由基清除法、邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法和鲁米诺-过氧化氢化学发光法检测结果比较,研究了该方法的可行性,以期为茶饮料抗氧化性能评价提供一种新方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪。

EGC、ECG、C、EC、GC、GA 标准储备溶 液:0.01 mol·L－1,分别称取一定质量标准品于小烧杯中,用少量乙醇溶解后转移至10 mL 容量瓶中,用水稀释至刻度。

EGCG 和GCG 标准储备溶液:0.01 mol·L－1,取一定质量标准品,用水溶解并定容至10.0 mL。

其他所需浓度的标准溶液均由上述溶液用水逐级稀释制得。

GA 标准品和鲁米诺为分析纯;C 标准品的纯度不小于97%;EC、EGC、ECG、GC、GCG、EGCG和DPPH 标准品的纯度均不小于98%;所用其他试剂均为分析纯;试验用水为高纯水;绿茶、乌龙茶、茉莉花茶和红茶饮料均采购于超市。

1.2 仪器工作条件

载流为纯水,蠕动泵转速为25 r·min－1,光电倍增管负高压为600 V。装置示意图见图1。

1.3 试验方法

1.3.1 Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法

通过蠕动泵将氧化剂3×10－5mol·L－1Ag(Ⅲ)溶液(内含0.1 mol·L－1氢氧化钠)和化学发光 剂1×10－7mol·L－1鲁米诺溶 液(内 含0.01 mol·L－1氢氧化钠)混合,再与载流混合流入检测池,测定产生的化学发光基线强度。切换进样阀,将样品溶液(将茶饮料用水稀释2 000倍制成)或1μmol·L－1的8种茶多酚化合物混合标准溶液由载液携带,与Ag(Ⅲ)溶液和鲁米诺溶液的混合液混合后流入检测池,测定由样品或标准物质引入所产生的化学发光峰值强度,计算化学发光强度差值(化学发光峰值强度与基线强度的差值)。

1.3.2 DPPH 自由基清除法

图1 装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the device

参考文献[8],加入1μmol·L－1茶多酚化合物的混合标准溶液或用水稀释2 000 倍的样品溶液0.2 mL,再加入水0.8 mL和0.002 5 g·L－1DPPH溶液(介质为乙醇)5 mL,混合均匀,室温避光反应30 min,以溶剂为参比,测定样品在517 nm 处的吸光度,记为A样品。以乙醇代替DPPH 溶液,测定吸光度,记为A空白。以水代替茶多酚化合物的混合标准溶液或样品溶液,进行对照试验,得到的吸光度,记为A对照。按公式(1)计算:

以8种目标化合物的浓度为横坐标,以自由基清除率为纵坐标构建线性回归方程,求出清除率为50%时对应的茶多酚化合物的浓度(IC50)。

1.3.3 邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法

参考文献[9],按1.3.1 节方法,其中,载流为Na HCO3-Na2CO3缓冲溶液,氧化剂为0.25 mmol·L－1邻苯三酚溶液,化学发光试剂为0.4 mmol·L－1鲁米诺溶液,其余仪器工作条件不变进行测定。

以8种目标化合物的浓度的自然对数为横坐标,以自由基清除率为纵坐标构建线性回归方程,求出清除率为50%时对应的茶多酚化合物的浓度(IC50)。

1.3.4 鲁米诺-过氧化氢化学发光法

参考文献[10],按1.3.1 节方法,其中,载流为Na HCO3-Na2CO3缓冲溶液,氧化剂为0.3%(体积分数)过氧化氢溶液,化学发光试剂为0.2 mmol·L－1鲁米诺溶液,其余仪器工作条件不变进行测定。

以8种目标化合物的浓度的自然对数为横坐标,以自由基清除率为纵坐标构建线性回归方程,求出清除率为50%时对应的各茶多酚化合物的浓度(IC50)。

2 结果与讨论

2.1 4种方法的结果分析

DPPH 自由基清除法(方法1)、邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法(方法2)、鲁米诺-过氧化氢化学发光法(方法3)和Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法(本方法)的测试结果见表1。

表1 4种方法的试验结果Tab.1 Results of tests of the 4 methods

由表1可知:DPPH 自由基清除法所得的8种茶多酚化合物IC50按照从小到大排序依次为GCG、EGCG、EGC、GC、ECG、GA、C、EC,说明GCG 对DPPH 自由基的清除能力最强,EC 对DPPH 自由基清除能力最弱;邻苯三酚-碳酸盐-鲁米诺化学发光法所得的8种茶多酚化合物的IC50按照从小到大排序依次为ECG、GCG、C、EGC、EGCG、GC、EC、GA,说明ECG 对O2－·的清除能力最强,而GA对O2－·清除能力最弱;鲁米诺-过氧化氢化学发光法所得的8种茶多酚化合物IC50按照从小到大排序依次为ECG、GCG、EC、EGCG、C、GA、EGC、GC,说明ECG 对过氧化氢清除能力最强,而GC清除过氧化氢的能力最弱;Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法所得的8种茶多酚化合物化学发光强度差值按照从小到大排序依次为EC、C、GA、ECG、GC、EGC、EGCG、GCG,说明GCG 与Ag(Ⅲ)的反应速度最快,最易被Ag(Ⅲ)氧化[15],抗Ag(Ⅲ)氧化活性最强,而EC与Ag(Ⅲ)的反应速率最慢,说明其最难被Ag(Ⅲ)氧化,抗Ag(Ⅲ)氧化活性最弱。前3种方法得到IC50的排序不同,是由于不同的茶多酚化合物捕获的活性物种不同(分别为DPPH 自由基、O2－·和过氧化氢活性氧),故表现出的抗氧化能力不同。DPPH 自由基清除法得到的8种茶多酚化合物的抗氧化能力大小排序与Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法的一致,这是由于这两种方法的信号强弱均与释放的活性氢和电子数目有关[16-17]。以DPPH 自由基清除法所得的IC50为横坐标,以Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法所得的化学发光强度差值为纵坐标绘制了线性拟合曲线(图2),其线性拟合方程为y＝－101.8x＋1 408,相关系数为0.949 0,进一步说明了2 种方法具有较好的相关性。

图2 2种方法的相关性Fig.2 Correlation between the 2 methods

2.2 样品分析

按照1.3.1节和1.3.2节试验方法,将Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法和DPPH 自由基清除法分别用于市售绿茶、乌龙茶、茉莉花茶和红茶饮料的抗氧化活性分析。结果表明:DPPH 自由基清除法所得的抗氧化能力绿茶最强,红茶最弱,乌龙茶和茉莉花茶能力相当;而Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法所得的化学发光强度差值排序按照从大到小的排序依次为绿茶、乌龙茶、茉莉花茶、红茶。

以DPPH 自由基清除法所得自由基清除率为横坐标,以Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法所得的化学发光强度差值为纵坐标绘制线性拟合曲线(图3),所得相关系数为0.966 5,说明Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法也能用于茶饮料中抗氧化活性的评价。

本工作采用Ag(Ⅲ)-鲁米诺流动注射化学发光法和文献报道的其他3种方法评价了8种茶多酚化合物的抗氧化活性,结果显示,本方法与DPPH 自由基清除法具有较好的一致性。将该法应用于4种茶饮料抗氧化活性的评价,所得结果也与DPPH 自由基清除法的一致,说明本方法可用于茶饮料的抗氧化活性评价。

图3 实际样品分析中2种方法的相关性Fig.3 Correlation between the 2 methods in analysis of the actual samples