破壁方式对微藻油脂提取物中脂肪酸的影响

付 懿，罗 琴，李 萌，陈亚兰，刘秋艳，罗 敏，丁青芝

江苏大学 食品与生物工程学院 (镇江 212013)

微藻中油脂含量十分丰富，其中的脂肪酸与植物油中的脂肪酸组成很相似是宝贵的油脂来源[1-2]。微藻中油脂的合成是在细胞内部完成并贮存在细胞中，并且微藻细胞核内也存在由微藻油脂形成的功能性组织，那么必须能让有机溶剂穿过微藻紧致的细胞壁和细胞膜，使有机溶剂与微藻油脂充分接触，才能提取较多油脂。但是由于海藻细胞壁致密性和细胞膜的选择透过性，所以弱极性的有机溶剂很难进入细胞内。因此，在提取微藻油脂之前，必须使用一定的机械或化学手段使微藻细胞壁破裂，例如挤压膨化、超声破碎、高压均质、酸热法等[3-4]。章莹颖等[5]将溶藻菌和其他细胞壁破碎技术相结合运用于到微藻油脂提取，并与其他物理和化学破壁方法进行了比较。结果表明:生物法和超声法的油脂提取率相对较高，因而更适合用于对微藻细胞壁破碎预处理。研究表明:微藻油脂提取技术只有与一定的细胞壁破碎技术相结合，才能达到较好的提取效果。机械法和化学法是常用的微藻破壁方法，也可以两种方法结合使用[6]。我们将对比研究不同破壁方法对藻油提取的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

超声波细胞粉碎机，无锡市上佳生物科技有限公司；HH6型恒温水浴，金坛医疗仪器厂；超声波清洗器，无锡市上佳生物科技有限公司；TGL-16型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机；SK-1型快速混匀器，江苏医疗仪器厂；BS224S型分析天平(精密度为0.000 1 g)，赛多利斯公司；BCD-639WKPZM型冰箱，美的集团；FJ200-S型实验室高速分散均质机均质机，韬越(上海)机械科技有限公司；SHJ-30型挤压膨化机，南京杰亚挤出设备有限公司；GC-2010型气相色谱，日本岛津集团。

1.2 试剂和材料

原料微拟球藻、膨化破壁的微拟球藻，山东烟台。

试剂：正己烷、乙醇均为分析纯；色谱纯甲醇；无水硫酸钠、氢氧化钾、硫酸，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1微藻油脂的提取

将膨化破壁后的微拟球藻干燥至恒重后放入粉碎机中粉碎80目过筛，精确称取4 g(精确到0.000 1 g)于250 mL的锥形瓶中加入转子，按料液比(w/v)为1∶25加入正己烷∶乙醇=10∶3混合溶剂100 mL封上保鲜膜后放入60 ℃恒温水浴锅，并设置转速800 r/min的磁力搅拌器上搅拌提取6 h，转移至离心杯中，配平后放入转速4 000 r/min离心机中离心分层15 min，再将含油脂的上清液转移至已称重的离心管中，底部残渣转移至已称重的培养皿中，在70 ℃的鼓风干燥烘箱中烘干至恒重，称重，计算油脂得率。

1.3.2微藻破壁方式

(1)反复冻融破壁

精确称取50 g(精度为0.000 1 g)未破壁的微拟球藻于大培养皿中，按照料液比(w/v)为1∶3加入150 mL蒸馏水后搅拌均匀，放入温度为-20 ℃的冰箱冷冻8 h，取出后放入60 ℃的水浴锅中融化，再放入-20 ℃的冰箱冷冻8 h，如此反复进行5次，最终溶化后将反复冻融破壁的藻液移入大培养皿中后，放入温度为70 ℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重，干燥后转移至粉碎机中粉碎后80目过筛，得到反复冻融破壁微藻备用。

(2)高压均质破壁

精确称取50 g(精度为0.000 1 g)未破壁的微拟球藻于500 mL烧杯中，按照料液比(w/v)为1∶4加200 mL蒸馏水后搅拌均匀，使用高速分散机进行破壁，转速为12 000 r/min，温度为25 ℃，均质5 min，间歇5 min，反复4次，均质总时间为20 min，将均质破壁后的藻液移入大培养皿中后，放入温度为70 ℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重，干燥后转移至粉碎机中粉碎后80目过筛，得到均质破壁微藻备用。

(3)超声破壁

精确称取37.5 g(精度为0.000 1 g)未破壁的微拟球藻与250 mL烧杯中，按照料液比(w/v)为1∶4加150 mL蒸馏水搅拌均匀，设置超声2 s，间隙2 s，总时间60 min，超声功率800 W，40 ℃恒温水浴，进行超声破壁，超声破壁后的藻液移入大培养皿中后，放入温度为70 ℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重，干燥后转移至粉碎机中粉碎后80目过筛，得到超声破壁微藻备用。

(4)膨化破壁

挤压膨化，温度为110 ℃，转速为200 r/min，在粉碎机中粉碎后80目过筛，得到超声破壁微藻。

1.3.3微藻油脂的甲酯化

试剂的配制：10 mol/L的氢氧化钾溶液；12 mol/L的硫酸溶液。甲酯化(测定反式脂肪酸TFA，游离脂肪总量)操作步骤如下。

(1)分别精确称取20 mg(精确至0.1 mg)4种破壁方式提取的油脂样品放在4个带盖的玻璃瓶中。

(2)再分别用移液管移入1 mL的内标液(1 mg内标Methyi pentadecanoate溶于5 mL色谱纯正己烷)于四个玻璃瓶中。

(3)接着再各自移入0.7 mL 10 mol/L KOH溶液和5.3 mL的CH4O，混匀。

(4)在水浴锅中反应90 min，水浴温度为55 ℃(每10 min混匀)。

(5)冷却至室温，移入0.58 mL 12 mol/L H2SO4溶液，翻转摇匀。

(6)再重复(4)中操作。

(7)冷却至室温，分别移入3 mL正己烷，漩涡混合器混合5 min。

(8)转速为4 000 r/min 离心15 min。

(9)将上清液分别移入4个放有1 mm无水硫酸钠的中号玻璃瓶中，静置10 min后用0.22 μm微孔过滤到脂肪酸小样品瓶中备用。

1.3.4微藻油脂脂肪酸含量的测定

脂肪酸检测时气相色谱条件为：SPL1温度250 ℃；SPL1压力40 kPa；总流量22.2 mL/min；吹扫流量3.0 mL/min；初始压力452 kPa；色谱柱初始温度140.0 ℃；FID1温度250.0 ℃；FID1尾吹N2流量30.0 mL/min，FID1氢气流量40.0 mL/min，FID1空气流量399.8 mL/min；进样量2 μL。梯度升温程序：0～2 min，140 ℃；2～45 min，220 ℃。

将已经甲酯化的四种不同破壁方式破壁的微藻油脂脂肪酸样品在气相色谱仪上一一进样检测，得到不同脂肪酸的气相色谱图，整理各自的保留时间和峰面积，计算不同脂肪酸相对含量。

2 结果与讨论

2.1 破壁方式对微藻油脂得率的影响

将之前处理的微藻样品进行混合溶剂(正己烷∶乙醇=10∶3, v/v)提取油脂试验，对比了反复冻融破壁、均质破壁、膨化破壁、超声破壁四种破壁方式对油脂得率的影响， 并且与未破壁微藻在相同条件下提取油脂的油脂得率进行了对比，结果见图1。

图1 破壁方式对油脂得率的影响

由图1可知，对比未破壁微藻与破壁微藻，微藻破壁后对油脂得率有着显著的影响。未破壁微藻的油脂得率仅为18.31%±0.29%，而反复冻融破壁微藻的油脂得率为24.89%±0.25%，均质破壁微藻的油脂得率为22.46%±0.17%，膨化破壁微藻的油脂得率为25.56%±0.12%，超声破壁微藻的油脂得率为26.19%±0.25%。

可以看出均质破壁微藻的油脂得率低于其他三种破壁微藻的油脂得率，这是因为均质的温度为室温25 ℃左右，对细胞壁的破碎程度不够。反复冻融主要是靠缓慢冻结形成较大的冰晶体而使微藻细胞壁和细胞膜破裂，并且冻结时间越长，形成冰晶体的体积会越大，对细胞壁和细胞膜的破坏程度越大，从而油脂得率相对高点。超声波是近年来备受青睐的破壁方式，可以看出除了与膨化破壁微藻的油脂得率相近以外，其油脂得率高出其他两种破壁方式的油脂得率。在此次试验中膨化破壁微藻的油脂得率也较高，这是因为膨化的条件占了很大的优势，膨化的温度为110 ℃，较高的温度会使得微藻细胞壁和细胞膜充分破裂，因而油脂得率相对较高。

2.2 脂肪酸组成分析

利用气相色谱仪分析脂肪酸，破壁方式对微藻油脂脂肪酸相对含量的影响见表1，不同类脂肪酸所占百分比见图2。

表1 不同破壁方式的微藻油脂脂肪酸相对含量

从表1中可以看出，使用混合溶剂正己烷∶乙醇=10∶3提取微藻中的油脂，经过脂肪酸成分的分析，主要成分为棕榈酸、棕榈油酸、十七酸和亚麻酸等，其含量较为丰富。对比不同破壁方式提油后脂肪酸分析得出，除了高压均质破壁微藻油脂中亚麻酸含量相对其他破壁方式提取油脂的亚麻酸含量相对高点，其他脂肪酸相对含量相差较小。微藻油脂中含有10%左右的亚麻酸，作为必需脂肪酸，对人体有很大的益处，皮肤病、肾脏肝脏功能的多种疾病是由于摄入的必需脂肪酸不足引起的。

注：横坐标1表示超声破壁微藻油脂；2表示反复冻融破壁微藻油脂；3表示高压均质破壁微藻油脂；4表示膨化破壁微藻油脂。 图2 不同破壁微藻油脂的不同类脂肪酸所占百分比

从图2可以看出，膨化破壁微藻油脂中饱和脂肪酸百分含量占到了54%，其他3种破壁方式的微藻油脂占到40%左右，说明膨化破壁更易于饱和脂肪酸的提取。橄榄油、菜籽油、花生油和坚果中的MUFA含量也很丰富，能够清除体内血液中的低密度脂蛋白，很受营养学方面的重视，微藻中单不饱和脂肪酸含量为40%，而花生油中含量为32%，橄榄油中含量为74%，大豆油中含量为27%，可见，微藻中MUFA的含量仅次于橄榄油。又因为微藻易于培养，产量高于橄榄，所以微藻具有很大的优势。

3 总结

(1)对比四种不同破壁方式的微藻通过混合溶剂正己烷∶乙醇(v/v)=10∶3提取油脂的得率大小，超声破壁和膨化破壁油脂得率相对较高，超声破壁微藻油脂得率为26.19%±0.25%，而微拟球藻中总脂含量大约30%，提取率达到了80%以上，因而提油效果最好。

(2)通过气相色谱仪检测微藻油脂中脂肪酸成分及含量，4种破壁方式对脂肪酸成分的影响较小，得到藻油脂中棕榈酸、棕榈油酸、十七酸和亚麻酸含量较为丰富。

(3)通过分析微藻油脂脂肪酸含量，除了膨化破壁微藻油脂中饱和脂肪酸含量为53%之外，其它破壁方式微藻油脂中SFA含量为40%以上，MUFA含量为40%左右，PUFA为10%左右。

(4)通过比较微藻油脂脂肪酸碳数，分析得到微藻油脂中脂肪酸偶数碳达到80%以上，因而可以得出微藻油脂中脂肪酸以偶数碳为主。