利用秸秆制备生化富里酸应用研究

黄明慧，张倩茹，韩梦琪，高希龙，李 华，罗 星

（中国农业大学烟台研究院，山东烟台264670）

目前，中国农作物秸秆综合利用率较低［1］，人们对小麦秸秆大多采取的是焚烧处理方式［2］，不仅易引发火灾，而且污染环境、浪费资源。花生是中国重要的油料作物之一［3］，花生秸秆产量较大，仅山东省就达489万t。因其营养丰富，常被用来作为牲畜的饲料。风干的花生秸秆硬度大，木质化程度高，适口性差，饲料化利用率较低［4］。花生红衣为花生深加工后的副产物，可入药，含丰富的多酚类物质，抗氧化活性强，可作为天然抗氧化剂［5］，对多种出血症也有较好的治疗效果［6］。其含有的原花青素，具有降血压、降血糖和抗过敏的作用。中国花生红衣产量约18万t/年，除了少量用于制药外，大部分成为固体废弃物［7］。

植物源生化富里酸（Biotechnology fulvic acid，BFA），是利用微生物发酵技术从植物源中制取的一种生物发酵产物。这种富里酸含矿物质、氨基酸、核酸、内源激素［8］等生物活性物质，能提高植物体内的多种酶活性，促进新陈代谢及农作物生长发育，是一种良好的植物生长调节剂［9］，可提高作物产量及改善品质［10］，增强作物抗逆性［11］，对农业生产方面大有益处。中国农业科学院研究得出，在施用相同化肥量的条件下，增施秸秆源富里酸肥料可显著提高作物产量［12］。富里酸具有较高的比表面积和螯合能力，能与金属离子、农药和多种有机物结合形成螯合物，影响土壤基质中有毒物质的滞留和释放状况［13］。刘厶瑶等［14］采用土壤培养试验研究了富里酸对土壤中污染水平较高的DNBP降解的动力学过程，表明适宜浓度的富里酸对DNBP的降解效果最佳。徐灿灿等［15］研究了富里酸与叶面硒肥同时作用时，可对低汞污染的油菜农田土壤有修复功能。Samavat等［16］研究了腐植酸物质对黄杨枯萎病的影响，表明腐植酸物质对病害有一定的防治效果。

以花生秸秆、小麦秸秆、花生红衣为原料，采用发酵法生产富里酸，研究不同原料的富里酸对植物生长的影响。尝试利用农作物秸秆通过微生物发酵制备生化富里酸，探索秸秆高附加值利用的新途径，期望服务于农业生产。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：花生秸秆、小麦秸秆采自中国农业大学烟台研究院实验基地；花生红衣取自山东威海临港区秀荣花生专业合作社；小麦种子（京冬22号）购置于烟台市芝罘区种子公司。

仪器：PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；WMK-08恒温培养箱，山东潍坊医疗器械厂；HWY-100B恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；旋转蒸发仪，德国海道尔夫公司。

药品：重铬酸钾、浓硫酸、硫酸亚铁、邻菲罗琳、氢氧化钠、焦磷酸钠均为分析纯，去离子水为实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 生化富里酸制备小麦秸秆、花生秸秆、花生红衣干燥后粉碎，过40目筛，密封4℃贮存。取500 g小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆和混合秸秆（小麦秸秆∶花生秸秆∶花生红衣=2∶2∶1）放入发酵桶中，加入20 g红糖、30 g玉米淀粉、5 g尿素、5 mL菌液，用去离子水调节含水率为60%～65%，放入培养箱中35℃发酵7 d。发酵后的物料按质量比1∶3加去离子水，搅拌均匀，挤压提取富里酸粗液。富里酸粗液中加入5 mL发酵菌，25℃曝气发酵72 h后，用焦磷酸钠与氢氧化钠的混合溶液调节发酵液至pH 8～10，静置1 h后过滤得到生化富里酸精制液［17］，利用旋转蒸发仪浓缩得到生化富里酸浓缩液。

1.2.2 富里酸含量测定采用重铬酸钾滴定法，称取试样于锥形瓶中，加入适量去离子水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加热溶解，期间搅动多次。30 min后取出锥形瓶，待冷却至室温后，将溶液及残渣全部转入容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去最初的部分滤液。准确吸取滤液于锥形瓶中，加入5 mL重铬酸钾溶液，缓慢加入浓硫酸15 mL，于沸水浴中加热氧化。30 min后将锥形瓶取出，冷却至室温，加入适量去离子水、2～3滴邻菲罗琳指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液由橙色经绿色转变为砖红色为终点［18］。

按下式计算出生化富里酸产率。

式中，V0表示滴定空白管所消耗的硫酸亚铁铵体积；V表示滴定样品管所消耗的硫酸亚铁铵体积；N表示硫酸亚铁铵标准溶液的浓度；0.003为碳的毫克当量；a表示样品溶液滴定的体积；b表示测定时所吸取的样品溶液的体积；G表示配制样品溶液时所加入的样品干重；C表示富里酸的含碳比（取0.5）。

1.2.3 发芽趋势生化富里酸浓缩液稀释20、15、12、10倍，去离子水为空白对照。将小麦种子用去离子水冲洗干净，放入铺有双层滤纸的培养皿中，每组放100粒，每个处理设3次重复。分别向培养皿中加入预先配制的不同种类、不同稀释倍数的富里酸溶液至种子高度的1/3～1/2，带孔保鲜膜覆盖，25℃恒温箱中培养144 h，观察发芽情况。胚根长度大于等于种子长度，胚芽长度大于等于种子长度的50%时认定为发芽［19］。

式中，Gt为在t日的发芽数；T为种子总数。

1.2.4 胚根测量每个培养皿中选取长势均一、健康的小麦幼苗30株，测其胚根长度，取平均值。

1.3 数据处理

利用Excel 2013软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵原料对生化富里酸产率的影响

用小麦秸秆、花生秸秆、花生红衣、混合秸秆发酵制备生化富里酸，采用容量法检测生化富里酸产率，结果见表1。由表1可知，发酵小麦秸秆和混合秸秆均具有较高的生化富里酸产率，其中，混合秸秆产率最高，达7.44%，较发酵花生红衣高2.87个百分点。表明小麦、花生秸秆的纤维素、半纤维素易降解，花生红衣降解较慢；但适当比例混合后发酵可充分发挥三者的协同作用，从而提高生化富里酸的产率。

表1 原料对富里酸发酵制备的影响

2.2 生化富里酸对发芽趋势的影响

用制备的生化富里酸稀释液（以花生秸秆源为例）进行小麦种子发芽趋势研究，以去离子水为空白对照。144 h发芽率变化如图1所示。24～96 h发芽程度随时间的延长而增加，96 h达最大；96～144 h发芽率变化不大。相对于空白对照，生化富里酸能明显提高种子的发芽率，在96 h生化富里酸提升发芽率15.00个百分点。表明生化富里酸中含对植物生长有促进作用的酶类、氨基酸、维生素和微量元素等生物活性物质［20］。

2.3 生化富里酸浓度对发芽率的影响

取自制生化富里酸溶液（以花生秸秆源为例）（4.92 g/L）分别稀释10、12、15、20倍，以去离子水为空白对照进行发芽率研究，结果如图2所示。与空白对照相比，生化富里酸稀释15、20倍能促进种子发芽，生化富里酸稀释10、12倍时抑制种子发芽，其中，稀释15倍时效果最好，能提升种子发芽率15.00个百分点。

图2 生化富里酸浓度对发芽率的影响

2.4 不同发酵原料生产的生化富里酸对发芽率的影响

利用小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆和混合秸秆为原料发酵，制备出4种不同的生化富里酸，在相同稀释浓度下（稀释15倍），以去离子水为空白对照进行发芽率试验，结果如图3所示。与空白对照相比，4种生化富里酸均能提高种子发芽率，但提高程度不同。其中，花生秸秆源生化富里酸效果最好，发芽率提升23.00个百分点；花生红衣、小麦秸秆、混合秸秆源生化富里酸发芽率分别提升15.00、7.00、10.00个百分点。表明花生秸秆发酵产生的生化富里酸具有较高的生物活性。

图3 不同源生化富里酸溶液对种子发芽率的影响

2.5 不同源生化富里酸对种子胚根长度的影响

取小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆和混合秸秆为原料生产的生化富里酸稀释液，处理小麦种子96 h，以去离子水为空白对照，选取各培养皿中长势均一、健康的幼苗30株，测其胚根长度，结果如表2所示。不同源的生化富里酸稀释液对种子胚根长度的影响趋势与其对发芽率的影响趋势相近，均明显促进种子胚根伸长。花生秸秆源生化富里酸稀释液对胚根长度促进作用最大，根长达39.4 mm，相比CK增加7.1%。小麦秸秆源生化富里酸稀释液促进作用不明显。

表2 不同源生化富里酸稀释液对种子胚根长度的影响

3 小结

利用小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆、混合秸秆发酵制备生化富里酸，研究不同稀释倍数的生化富里酸溶液对小麦种子发芽率的影响及不同源生化富里酸的生理活性，得出主要结论如下。

1）不同原料制备生化富里酸的产率不同。混合原料（小麦秸秆∶花生秸秆∶花生红衣=2∶2∶1）具有较高产率，达7.44%，小麦秸秆生化富里酸产率为6.79%。

2）不同稀释倍数的生化富里酸对种子萌发的影响不同。高浓度的生化富里酸溶液对种子发芽有抑制作用，低浓度有促进作用。其中，生化富里酸溶液（4.92 g/L）稀释15倍具有较好的生理活性。

3）不同原料源生化富里酸生理活性有一定差异。其中，花生秸秆源生化富里酸溶液生理活性最佳，可明显提高种子发芽率及促进胚根伸长，对植物生长有一定的促进作用。