一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

胡逸超 卢晓静 李璞 廖咏梅 何新华 邹承武 陈琦

摘要：【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）序列特征，为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料，取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA，并进行小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列，利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads），长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度，占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt，编码3105个氨基酸，其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%，暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示，SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分離物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上，分析该病毒的vsiRNA特征，结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度，病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖，且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4，DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1，AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切，主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA，从而抑制SMV在植株体内的复制。

关键词： 掌叶半夏;病毒基因组;大豆花叶病毒;小RNA深度测序;vsiRNA

中图分类号： S432                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）12-3392-08

Characterization of virus-derived small interfering RNAs and complete sequence of a strain of Soybean mosaic virus

infected Pinellia pedatisecta

HU Yi-chao1， LU Xiao-jing2，3， LI Pu4， LIAO Yong-mei2， HE Xin-hua2，

ZOU Cheng-wu2*， CHEN Qi4*

（1Technical Center，China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Nanning  530001， China; 2 National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education， College of Agriculture， Guangxi University， Nanning  530004， China; 3Nanning Center for Disease Control and Prevention， Nanning  530023， China; 4Nanning Gold-tech

Bio-science Co.， Ltd.， Nanning  530001， China）

Abstract：【Objective】To illuminate the virus silencing mechanism in Pinellia pedatisecta， performed an analysis of the sequence characteristics of virus-derived small interfering RNA （vsiRNA） in a Soybean mosaic virus （SMV） infec-ting P. pedatisecta. 【Method】In this study， a plant of P. pedatisecta， which displayed typical virus infection symptoms， was found in Guangxi. The total RNA of the chlorotic and mottled leaves was extracted using the TRIzol method. A small RNA deep sequencing was employed to identify the vsiRNA. The full-length genome sequence of the virus was obtained by rapid amplification of cDNA ends （RACE） and segmented cloning. The phylogenetic relationships of the assembled virus sequence was analyzed using MEGA 7.0  software. The characterization of vsiRNA was performed using the cloned genome as a reference sequence. 【Result】In total， 4851249 high-quality reads， in which the relatively rich reads were 21， 22， and 24 nt with the percentage of 33.4%， 13.7% and 11.3%， respectively， were obtained by small RNA deep sequencing. According to the small RNA sequencing results， the full-length genome sequence cloning of the virus was carried out. The virus genome was found to be 9735 nt in length， encoding a polyprotein that contained 3105 amino acids. Sequence analysis showed that the nucleotide sequence of the virus isolate genome shared 86.93% identical identity with the SMV HZ1 isolate. This virus isolate was named SMV NN tentatively. The phylogenetic relationship anlysis revealed that the SMV NN shared the closest genetic relation with the SMV HZ1 isolated from P. ternate. The small RNAs of the virus were mapped to the genome of SMV NN for vsiRNA characterization. The results showed that the vsiRNA with lengths of 21 nt and 22 nt was in high abundance; both positive and negative virus vsiRNA could cover the entire virus genome and had the strongest hot spots in the HC-Pro and P3 protein-coding regions， respectively. 【Conclusion】P. pedatisecta mainly uses dicer like ribonuclease 4 （DCL4） and Argonaute1 （AGO1） to cleave the HC-Pro and P3 domain of SMV， and mainly produces vsiRNA with the lengths of 21 nt and 22 nt， resulting in the inhibition of SMV replication in plants.

Key words： Pinellia pedatisecta; rirus genome; Soybean mosaic virus; small RNA deep sequencing; vsiRNA

Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Special Project （Major Science and Technology Proje-cts） （Guike AA17204054）; Project of China Tobacco Guangxi Industrial Company （Keji 20190029）

0 引言

【研究意义】掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）是我国特有的天南星科（Araceae）植物，其药材名为虎掌，具有镇痛、抗惊厥和治疗心血管疾病等多种功效（Lin et al.，2007;刘寨东等，2009;Wang et al.，2019）。掌叶半夏分布于我国大部分地区，近年来快繁技术的发展极大地促进了半夏种植面积的快速扩大（张庚等，2017）。但随着掌叶半夏病毒性病害的日益凸现，其产量和质量受到不同程度的影响。掌叶半夏以无性繁殖为主，病毒一旦侵染将会不断积累，可使叶片出现花叶、褪绿斑驳、皱缩、植株矮化甚至坏死等症状，严重影响植株生长，长此以往将会造成植物种质退化（解红娥等，2005;李会等，2016）。深入研究掌叶半夏的病原病毒种类和病毒衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）特征，将为掌叶半夏沉默病毒的作用机制研究提供重要参考，为掌叶半夏病毒病防治提供科学依据。【前人研究进展】RNA沉默在植物抵御病毒入侵过程中起着关键作用（Zhao et al.，2020）。RNA病毒是RNA沉默機制的强烈诱导物，具有颈环结构的区域通过病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）合成，成为复制中间产物，进而作为病毒相关模式分子被DCL（Plant Dicer-like）与AGO（Argonaute）识别并剪切成21～24 nt的vsiRNA（Pumplin and Voinnet，2013;Li and Wang，2018）。RNA沉默具有信号放大的机制，22 nt的病毒小RNA与单链病毒RNA互补区域结合，通过宿主编码的RdRp进行RNA延伸，生成可以被剪切为次级vsiRNA的dsRNA（Chen et al.，2010）。2种vsiRNA均可与AGO蛋白结合通过转录后途径（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）引导RNA沉默，但以次级vsiRNA为主通过核酸互补形成贯穿植物体的剪切信号，为植物提供有效的保护（Schwach et al.，2005;Ramesh et al.，2021）。在拟南芥中dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4，DCL4）、DCL2和DCL3分别负责生成21、22和24 nt的vsiRNA，DCL4最先起作用，同时也被认为是RNAi中最活跃的作用者，其所生成的21 nt vsiRNA在感染RNA病毒的植物中一般占绝大多数（Ding and Voinnet，2007）。研究人员对DCL4进行突变后，DCL2的作用增强，生成更多22 nt的vsiRNA，说明22 nt vsiRNA在对抗病毒的过程中具有特定作用（Bouché et al.，2006）。但22 nt的vsiRNA并不能引导RNA病毒高效剪切（Wang et al.，2011）。目前认为22 nt的vsiRNA主要在次级vsiRNA产生过程中发挥作用（Chen et al.，2010;Wang et al.，2018）。【本研究切入点】小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）作为高通量测序技术的重要应用，可同时获得病毒和宿主的小RNA序列，是研究RNA沉默机制的有效工具。随着小RNA深度测序深度的不断发展，小RNA深度测序数据高度重叠，并能组装得到病毒全长，其在病毒的鉴定和新病毒的发现方面具有广阔的前景（Wu et al.，2010）。一些模式生物的研究显示，vsiRNA具有独特的特征，是病毒入侵的重要标志（Li et al.，2013;Miozzi et al.，2013;Niu et al.，2017）。然而，目前采用小RNA深度测序开展掌叶半夏的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为研究对象，通过小RNA深度测序，对其vsiRNA特征进行深入分析，以期为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

供试的疑似病毒病掌叶半夏（P. pedatisecta）样品采集自广西药用植物园，症状表现为叶片褪绿斑驳。主要试剂：TRIzol和DNA分子量标准（GeneRulerTM 1 kb Puls DNA ladder）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;TruSeq Small RNA Library Preparation Kits购自Illumina公司;PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒、Ex TaqTM DNA聚合酶、Clonetech SMARTer RACE 5'/3'试剂盒和pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司;胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;肠杆菌DH5α感受态细胞由本课题组制备保存。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：5310高速离心机（Eppendorf，德国）、HiSeq 2500测序仪（Illumina，美国）、ProFlex PCR仪（Thermo Fisher，美国）、PCR仪（杭州博日科技股份有限公司）、电泳系统（北京六一生物科技有限公司）和GBOX-HR全自动凝胶成像系统（Syngene，英国）。

1. 2 总RNA提取和小RNA深度测序分析

采用TRIzol法提取掌叶半夏样品的总RNA，样品检测合格后委托广西普斐信息科技有限公司进行小RNA深度测序和数据分析。主要建库测序和数据分析流程包括：参考小RNA文库制备指南（TruSeq Small RNA Library Preparation Reference Guide，https：//support.illumina.com/sequencing/sequencing_ kits/truseq-small-rna-kit/documentation.html）中描述的方法构建小RNA测序文库，文库质量检测合格后使用Hiseq 2500平台（Illumina，美国）进行测序;采用CLC genomic workbench 12.0（Qiagen，德国）中的Trimming程序去除测序结果中质量值低于Q30、含有5'接头和测序引物及不含有3'接头的读段（reads），以及<15 nt和>30 nt的reads;使用CLC geno-mic workbench 12.0中的从头组装（Denovo assembly）算法对高质量reads进行组装，k-mer值设为17，使用映射（mapping）reads到参考序列的工具将组装获得的邻接片段（Contigs）定位到病毒参考序列;高质量的reads采用RNA-Seq分析工具映射到病毒的基因组上，允许2个碱基错配;对vsiRNA进行长度分布统计、极性分布分析、5'端起始碱基偏好性分析及热点区分布分析。

1. 3 病毒基因组全长序列克隆

参考小RNA测序的组装结果与序列一致性最高的病毒参考基因组序列的保守区，使用Primer Premier 6.0设计引物，引物序列如表1所示，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。以提取的病样总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，以此为模板进行PCR分段扩增病毒基因组。PCR扩增体系20 ?L：cDNA模板1 ?L，2×Ex Taq Master Mix 10 ?L，正、反向引物各1 ?L，ddH2O补足至20 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 15 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30次循环。所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测。使用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA ends，RACE）技术克隆病毒cDNA末端序列，具体操作参考Clonetech SMARTer RACE产品说明书（https：//www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/race-kits/smarter-5-race-and-3-race）。切胶回收符合预期大小的目标PCR产物，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，进行TA克隆并将阳性克隆进行序列测定。将获得的病毒序列进行拼接获得病毒的基因组全长序列。

1. 4 系统发育进化树构建

将克隆获得的侵染掌叶半夏的病毒全长基因组序列在NCBI网站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用基本局部对齐搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool）进行核苷酸序列比对分析，获得病毒的核苷酸序列一致性信息，选择有代表性的病毒序列信息，利用MEGA 7.0构建系统发育进化树，并分析其亲缘关系。

2 结果与分析

2. 1 小RNA深度测序和病毒种类鉴定结果

小RNA深度测序共获得14500000条长度为35 bp左右的reads，使用严格的参数对测序结果进行质量评估和筛选，获得4851249条高质量的reads，其中长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度，分别占所有高质量序列的33.4%、13.7%和11.3%（图1-A）。已报道的植物内生小RNA深度测序结果显示，芥菜（Brassica juncea）中21 nt的reads最多（Ho et al.，2007），拟南芥（Arabidopsis thaliana）24 nt的reads最多（Wang et al.，2011），而在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中22 nt的reads最多（Mitter et al.，2013）。不同的植物所产生的小RNA在长度分布各具特点，其原因可能是自身RNA沉默机制不同所至。由于目前尚无来源于掌叶半夏的病毒全基因组序列信息，不能直接以基因组序列作为参考提取与其同源的reads。为获得来源于病毒的reads，本研究将所有高质量reads与GenBank的病毒核酸数据库进行比对，发现比对上的reads在21和22 nt处具有最高丰度，而24 nt的reads数量超过22 nt的reads，但大都没有比对上病毒序列（图1-B）。

对所有高质量reads进行组装，获得792条长度大于50 bp的Contigs，将这些Contigs与GenBank的病毒核酸数据库进行核苷酸序列比对（BLASTn），结果发现有109条Contigs的与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）具有较高的序列一致性，说明SMV是这株掌叶半夏的主要病原病毒。使用SMV G7分离物（登录号AY216010.1）的全基因组作为参考序列，将组装获得的Contigs定位到参考序列，能不连续覆盖G7的73%序列，且在5'末端具有一个1066的空缺，说明侵染掌叶半夏的SMV在5'可能存在较大变异（图1-C）。

2. 2 SMV广西分离物的全长克隆

为获得侵染掌叶半夏的SMV的全基因组序列，根据小RNA深度测序组装得到的病毒序列信息及其在参考基因组上的定位结果设计引物，使用RT-PCR、5' RACE和3' RACE技术对其全基因组进行分段扩增和克隆，并采用Sanger法进行序列测定。结果（图2）发现，设计的3对引物分别扩增得到长度为2765、2705和2528 bp的3个片段，末端序列采用5' RACE和3' RACE技术分别获得1296和604 bp的片段。組装获得其全基因组长度为9735 nt，不包括Poly（A）的长度。该病毒基因组包含一个长为9315 nt的开放阅读框架（Open Reading Frame，ORF），编码一个包含3105个氨基酸的多聚蛋白，符合马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型特征。

经BLAST比对，发现其与SMV HZ1分离物（登录号AJ628750）的核苷酸序列相似性最高，为86.93%。因此，将侵染掌叶半夏的SMV南宁分离物暂命名为SMV NN，其基因组序列已提交GenBank核酸序列数据库（登录号KF982784.1）。使用SMV NN全基因组序列与SMV的其他代表性分离物（表2）一起构建系统发育进化树，发现其与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近，而且来源于半夏的SMV分离物聚在一个分支，来源于大豆的SMV分离物聚在另外一个分支（图3）。

2. 3 SMV的vsiRNA特征分析

以克隆测序获得的SMV NN分离物的基因组作为参考序列，将所有高质量reads进行mapping分析，发现有237864条reads能mapping到SMV NN的基因组上，占所有高质量reads的4.9%。来自于SMV NN的vsiRNA中几乎都是21和22 nt，分别占所有vsiRNA的75.4%和19.6%（图4）。

vsiRNAs是通过Dcr-2蛋白处理病毒基因组复制期间形成的dsRNA所生成，在较小程度上是通过病毒转录生成（Marques et al.，2013）。为进一步明确Dcr-2蛋白对病毒dsRNA的作用方式，本研究对SMV NN 21 nt vsiRNA 5'末端碱基进行分析，其中U、A和C分别占43.9%、27.7%、20.6%。对序列分布情况分析发现，正链和负链vsiRNA均能覆盖SMV NN的基因组，分别占比对上的读段（Mapped reads）的59.9%和40.1%，同时发现vsiRNA在病毒大部分蛋白编码区均具有热点，而且正链和负链vsiRNA分别在HC-Pro与P3蛋白编码区内具有覆盖度超过5000倍的热点。

3 讨论

随着第二代测序技术的进步和测序成本的降低，小RNA深度测序的应用越来越广泛，并在病毒鉴定和新病毒发现等方面做出了巨大贡献。多个研究表明，使用小RNA深度测序可发现新病毒并组装出新病毒的全基因组序列（Wu et al.，2010;Niu et al.，2017）。但由于vsiRNA较短，通过Denovo组装获取完整病毒基因组序列仍存在挑战性。同时，由于病毒变异快和高通量测序的误差等原因，通过新开发的专门针对小RNA组装的算法获得的组装结果也不理想，而且通过比对与组装等方法所得到的病毒序列还需进一步实验验证。但是，即使不能组装出完整的病毒基因组，仍可使用RT-PCR和RACE技术获得其全长序列。小RNA深度测序结合常规克隆测序的方法不依赖高质量组装，适用性也更广，降低了获取病毒基因组全长序列的难度，是鉴定和发现新病毒的有效途径。本研究结合小RNA深度测序及常规的病毒序列克隆测序技术，相互完善互补，所获得的病毒基因组序列较完整，为分析vsiRNA提供了很好的基础。几乎全部vsiRNA均能mapped到病毒基因组上也说明所获序列的完整性。

目前的研究表明，vsiRNA具有的特征是宿主和病毒相互作用的结果（Pooggin，2018）。不同病毒的vsiRNA特征不同，侵染不同宿主后vsiRNA特征也会发生改变，通过vsiRNA特征的研究，可揭示病毒与宿主相互作用深层次的作用机理（Pooggin，2018）。研究发现，去除病毒相关的reads后，其reads分布与未受芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）侵染的芥菜中的reads分布相似，而未去除病毒相关reads的情况则与芥菜受TuMV侵染后的reads分布类似，但2种分布情况与在大豆受SMV侵染后小RNA的研究中发现的reads分布情况不符，其原因尚不清楚（Ho et al.，2007;Yin et al.，2013）。但这些宿主侵染马铃薯Y病毒后21和22 nt的reads均大幅增加，可能是植物感染马铃薯Y病毒的共同特征，同时21与22 nt reads的显著增加可能是RNA病毒侵染和植物抗病毒机制启动的明显标志。

21 ntvsiRNA被认为是DCL4与AGO蛋白的产物，而22 nt vsiRNA被认为是 DCL2与AGO的产物，同时21 nt vsiRNA引导RNA病毒的高效剪切（Ho et al.，2007;Wang et al.，2011）。但侵染拟南芥的兰花环斑病毒（Cymbidium ringspot virus）和马铃薯X病毒（Potato virus X）却是22 nt的vsiRNA最多，其原因可能是这些病毒具有抵抗RNA剪切的机制，从而抑制了DCL4的剪切，兰花环斑病毒中的P19蛋白被证明通过与vsiRNA结合而具有抗RNA沉默的作用（Lakatos et al.，2004;Donaire et al.，2009）。SMV NN侵染掌叶半夏所产生的21 nt vsiRNA最多，说明DCL4可能是主要作用者。AGO蛋白具有5'末端的偏好性，与21 nt vsiRNA作用的Argonaute蛋白1（Argonaute1，AGO1）、AGO2和AGO5分别在5'末端具有U、A、C的偏好性（Mi et al.，2008）。对SMV NN 21 nt vsiRNA 5'末端碱基进行分析，发现U、A和C 3种碱基均存在，且比例均大于20%，其中U碱基的比例最高，说明掌叶半夏对SMV NN的剪切可能有多种AGO蛋白参与，其中AGO1可能起主要作用。vsiRNA在SMV NN上的分布较广，涉及病毒大部分蛋白编码区，说明掌叶半夏RNA沉默机制可对SMV大多数蛋白编码区域进行剪切。特别在HC-Pro与P3蛋白编码区内，具有覆盖度超过5000倍的热点，表明掌葉半夏对HC-Pro与P3蛋白编码区域具有强烈的剪切作用，可能与掌叶半夏对抗SMV反RNA沉默的机制有关，与Eggenberger等（2008）报道的HC-Pro蛋白具有抵抗RNA沉默的功能，而P3和HC-Pro共同对SMV的毒力产生影响的结论一致。

一些病毒蛋白具有保护病毒RNA免于RNA剪切的功能，马铃薯Y病毒中HC-Pro可抑制RNA沉默，促进病毒在宿主体内的长距离移动，而P3和HC-Pro同时影响病毒的毒力（Kasschau et al.，2003;Eggenberger et al.，2008）。江彤等（2013）的HC-Pro设计RNA干扰载体试验证明了P3和HC-Pro在RNA沉默中的作用。因此，根据掌叶半夏SMV vsiRNA的热点可有效设计RNA沉默载体，从而对掌叶半夏SMV病进行防治。马铃薯Y病毒通过衣壳将正链RNA包被起来，起到保护作用，SMV正链vsiRNA多于负链，可能在病毒表达过程中，正链具有更重要的作用，因此宿主对其剪切作用更强。然而病毒的负链能作为正链复制的模板，负链的断裂会影响病毒的复制。本研究发现vsiRNA在SMV负链P3区域具有非常强的热点，占所有负链vsiRNA的9.4%。在SMV多样性研究中，P3区域的氨基酸序列高度保守（Seo et al.，2009）。推测掌叶半夏可能通过剪切SMV保守的负链P3区域以抑制SMV的复制。

4 结论

利用小RNA深度测序技术结合RACE和分段克隆测序技术获得侵染掌叶半夏的SMV NN分离物的病毒全基因组序列，分析发现感染SMV的掌叶半夏在沉默病毒过程中所产生vsiRNA的长度主要为21和22 nt，表明其对病毒起主要剪切作用的为DCL4;vsiRNA的5末端偏好性分析发现，AGO1可能为掌叶半夏抑制SMV复制的主要作用蛋白;vsiRNA热点分析发现掌叶半夏主要对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区起主要剪切作用。研究结果可为深入认识掌叶半夏沉默病毒的作用机制提供参考。

参考文献：

江彤，邓竹根，宋培培，陈伟，丁菲，贾琳. 2013. 利用dsRNA介导的抗病性获得抗马铃薯Y病毒（PVY）的转基因烟草[J]. 热带作物学报，34（4）：648-653. [Jiang T，Deng Z G，Song P P，Chen W，Ding F，Jia L. 2013. Transgenic tobacco plants resistant to Potato virus Y（PVY） via dsRNA-mediated virus resistance[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，34（4）：648-653. doi：10.3969/j.issn.1000-2561. 2013.04. 012.]

李会，张庚，孟义江，葛淑俊. 2016. 掌叶半夏微茎尖培养脱毒和快繁体系的建立[J]. 作物杂志，（3）：51-57. [Li H，Zhang G，Meng Y J，Ge S J. 2016. Establishment of virus-elimination and rapid propagation system of Pinellia pedatisecta Schott[J]. Crops，（3）：51-57.] doi：10. 16035/j.issn.1001-7283.2016.03.010.

刘寨东，王家鹏，李红霞. 2009. 半夏在肿瘤疾病临证中的研究及应用[J]. 食品与药品，11（3）：75-76. [Liu Z D，Wang J P，Li H X. 2009. Research and application of Pinellia ternata in clinical sign of tumor disease[J]. Food and Drug，11（3）：75-76.]  doi：10.3969/j.issn.1672-979X.2009.02.026.

解紅娥，解晓红，李江辉，陈丽，武宗信，郝建平. 2005. 半夏的病毒危害及脱毒快繁技术研究[J]. 中草药，36（11）：1697-1700. [Xie H E，Xie X H，Li J H，Chen L，Wu Z X，Hao J P. 2005. Virus damage to Pinellia ternata and its rapid-proliferation technique for virus-free seedlings[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，36（11）：1697-1700.] doi：10.3321/j.issn：0253-2670.2005.11.041.

张庚，靳小莎，葛淑俊. 2017. 天南星生产技术研究进展[J]. 中药材，40（7）：1747-1751. [Zhang G，Jin X S，Ge S J. 2017. Research progress in Arisaema consanguineum produce technology[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials，40（7）：1747-1751.] doi：10.13863/j.issn1001-4454.2017.07. 055.

Bouché N，Lauressergues D，Gasciolli V，Vaucheret H. 2006. An antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in develo-pment and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs[J]. The EMBO Journal，25（14）：3347-3356. doi：10.1038/sj.emboj.7601217.

Chen H M，Chen L T，Patel K，Li Y H，Baulcombe D C，Wu S H. 2010. 22-nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants[J]. Proceedings of the National Aca-demy of Sciences of the United States of America，107（34）：15269-15274. doi：10.1073/pnas.1001738107.

Ding S W，Voinnet O. 2007. Antiviral immunity directed by small RNAs[J]. Cell，130（3）：413-426. doi：10.1016/j.cell.2007.07.039.

Donaire L，Wang Y，Gonzalez-Ibeas D，Mayer K F，Aranda M A，Llave C. 2009. Deep-sequencing of plant viral small RNAs reveals effective and widespread targeting of viral genomes[J]. Virology，392（2）：203-214. doi：10.1016/j.virol.2009.07.005.

Eggenberger A L，Hajimorad M R，Hill J H. 2008. Gain of virulence on Rsv1-genotype soybean by an avirulent Soybean mosaic virus requires concurrent mutations in both P3 and HC-Pro[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，21（7）：931-936. doi：10.1094/MPMI-21-7-0931.

Ho T，Wang H，Pallett D，Dalmay T. 2007. Evidence for targeting common siRNA hotspots and GC preference by plant Dicer-like proteins[J]. FEBS Letters，581（17）：3267-3272. doi：10.1016/j.febslet.2007.06.022.

Kasschau K D，Xie Z X，Allen E，Llave C，Chapman E J，Krizan K A，Carrington J C. 2003. P1/HC-Pro，a viral suppressor of RNA silencing，interferes with Arabidopsis development and miRNA function[J]. Developmental Cell，4（2）：205-217. doi：10.1016/S1534-5807（03）00025-X.

Lakatos L，Szittya G，Silhavy D，Burgyán J. 2004. Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses[J]. The EMBO Journal，23（4）：876-884. doi：10.1038/sj.emboj.7600096.

Li F F，Wang A M. 2018. RNA decay is an antiviral defense in plants that is counteracted by viral RNA silencing sup-

pressors[J]. PLoS Pathogens，14（8）：e1007228. doi：10.

1371/journal.ppat.1007228.

Li J M，Andika I B，Shen J F，Lü Y D，Ji Y Q，Sun L Y，Chen J P. 2013. Characterization of Rice black-streaked dwarf virus-and Rice stripe virus-derived siRNAs in singly and doubly infected insect vector Laodelphax striatellus[J]. PloS One，8（6）：e66007. doi：10.1371/journal.pone.0066 007.

Lin J，Zhou X W，Gao S，Liu X J，Wu W S，Sun X D，Tang K X. 2007. cDNA cloning and expression analysis of a mannose-binding lectin from Pinellia pedatisecta[J]. Journal of Biosciences，32（2）：241-249. doi：10.1007/s12038-007-0024-1.

Marques J T，Wang J P，Wang X H，de Oliveira K P V，Gao C，Aguiar E R G R，Jafari N，Carthew R W. 2013. Functional specialization of the small interfering RNA pathway in response to virus infection[J]. PLoS Pathog，9（8）：e1003579. doi：10.1371/journal.ppat.1003579.

Mi S J，Cai T，Hu Y G，Chen Y M，Hodges E，Ni F R，Wu L，Li S，Zhou H Y，Long C Z，Chen S，Hannon G J，Qi Y J. 2008. Sorting of small RNAs into Arabidopsis argonaute complexes is directed by the 5' tutterminal nucleotide[J]. Cell，133（1）：116-127. doi：10.1016/j.cell.2008.02.034.

Mitter N，Koundal V，Williams S，Pappu H. 2013. Differential expression of Tomato spotted wilt virus-derived viral small RNAs in infected commercial and experimental host plants[J]. PLoS One，8（10）：e76276. doi：10.1371/journal.pone.0076276.

Miozzi L，Pantaleo V，Burgyán J，Accotto G P，Noris E. 2013. Analysis of small RNAs derived from tomato yellow leaf curl Sardinia virus reveals a cross reaction between the major viral hotspot and the plant host genome[J]. Virus Research，178（2）：287-296. doi：10.1016/j.virusres.2013. 09.029.

Niu X R，Sun Y，Chen Z，Li R G，Padmanabhan C，Ruan J S，Kreuze J F，Ling K S，Fei Z J，Gao S. 2017. Using small RNA-seq data to detect siRNA duplexes induced by plant viruses[J]. Genes，8（6）：163. doi：10.3390/genes8060163.

Pooggin M M. 2018. Small RNA-omics for plant virus identification，virome reconstruction，and antiviral defense chara-cterization[J]. Frontiers in Microbiology，9：2779. doi：10.3389/fmicb.2018.02779.

Pumplin N，Voinnet O. 2013. RNA silencing suppression by plant pathogens：Defence，counter-defence and counter-counter-defence[J]. Nature Reviews Microbiology，11（11）：745-760. doi：10.1038/nrmicro3120.

Ramesh S V，Yogindran S，Gnanasekaran P，Chakraborty S，Winter S，Pappu H R. 2021. Virus and viroid-derived small RNAs as modulators of host gene expression：Molecular insights into pathogenesis[J]. Frontiers in Microbiology，11：614231. doi：10.3389/fmicb.2020.614231.

Schwach F，Vaistij F E，Jones L，Baulcombe D C. 2005. An RNA-dependent RNA polymerase prevents meristem invasion by potato virus X and is required for the activity but not the production of a systemic silencing signal[J]. Plant Physiology，138（4）：1842-1852. doi：10.1104/pp. 105.063537.

Seo J K，Ohshima K，Lee H G，Son M，Choi H S，Lee S H，Sohn S H，Kim K H. 2009. Molecular variability and genetic structure of the population of Soybean mosaic virus based on the analysis of complete genome sequences[J]. Virology，393（1）：91-103. doi：10.1016/j.virol.2009.07.007.

Wang T，Deng Z Q，Zhang X，Wang H Z，Wang Y，Liu X Y，Liu S Y，Xu F，Li T，Fu D Q，Zhu B Z，Luo Y B，Zhu H L. 2018. Tomato DCL2b is required for the biosynthesis of 22-nt small RNAs，the resulting secondary siRNAs，and

the host defense against ToMV[J]. Horticulture Research，

5，62. doi：10.1038/s41438-018-0073-7.

Wang X B，Jovel J，Udomporn P，Wang Y，Wu Q F，Li W X，Gasciolli V，Vaucheret H，Ding S W. 2011. The 21-nucleo-tide，but not 22-nucleotide，viral secondary small interfe-ring RNAs direct potent antiviral defense by two cooperative argonautes in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Cell，23（4）：1625-1638. doi：10.1105/tpc.110.082305.

Wang Y M，Huang H X，Yao S，Li G L，Xu C J，Ye Y，Gui S Q. 2019. A lipid-soluble extract of Pinellia pedatisecta Schott enhances antitumor T cell responses by restoring tumor-associated dendritic cell activation and maturation[J]. Journal of Ethnopharmacology，241：111980. doi：10. 1016/j.jep.2019.111980.

Wu Q F，Luo Y J，Lu R，Lau N，Lai E C，Li W X，Ding S W. 2010. Virus discovery by deep sequencing and assembly of virus-derived small silencing RNAs[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，107（4）：1606-1611. doi：10.1073/pnas.09113 53107.

Yin X C，Wang J，Cheng H，Wang X L，Yu D Y. 2013. Detection and evolutionary analysis of soybean miRNAs responsive to soybean mosaic virus[J]. Planta，237（5）：1213-1225. doi：10.1007/s00425-012-1835-3.

Zhao Y L，Yang X，Zhou G H，Zhang T. 2020. Engineering plant virus resistance：From RNA silencing to genome edi-ting strategies[J]. Plant Biotechnology Journal，18（2）：328-336. doi：10.1111/pbi.13278.

（責任编辑 麻小燕）