Angiotensin II 通过氧化应激引起巨噬细胞AMPK/SIRT1 能量信号紊乱

肖 珊，马郁文，李 婧，张彦红，何 泓，方春香，王万铭

1华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院药学部，湖北 武汉430014；2广州中医药大学中药学院，广东广州511400；3广州市第一人民医院中医科，广东 广州511400；4广州医科大学第三附属医院妇产科，广东 广州511400；5长江航运总医院，湖北 武汉430000；6武汉脑科医院，湖北 武汉430000

心血管疾病在全球范围内有着很高的致死率，其发病机制是一个非常复杂的过程，包括了炎症的发生以及血管的病变等［1-2］。血管紧张素II（Ang II）是RAAS的血管活性肽，具有强效收缩血管作用，与心血管疾病的发生发展密切相关，在高血压调节中起重要作用［3-4］。Ang II通过与特定受体结合来调节自身作用从而调节心血管稳态，AT1受体参与血管紧张素的主要病理生理作用［5-6］。在低血压状态下，Ang II通过AT1激活RAS系统后，通过促进Ca2+流入增加引起的血管收缩，减少NO 产生并且刺激醛固酮的产生，同时增加炎症因子的表达，从而能促进自身免疫功能障碍的发展［7-8］。单磷酸腺苷活化蛋白激酶AMPK是一种应激活的蛋白酶，是细胞ATP水平的代谢传感器，是关键调节因子也是一种氧化还原敏感酶［9］。SIRT1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，在炎症反应和免疫中发挥多种作用［10］。研究发现AMPK 的激活可提高细胞内NAD+浓度，从而激活SIRT1的表达。AMPK和SIRT1对机体的能量代谢敏感，两者发挥着协调作用共同维持着机体能量稳态［11］。近年来有文献报道，Ang II通过抑制AMPK/SIRT1通路促进心血管疾病的发生发展［12-13］，但是具体的机制尚未阐明。本研究通过构建Ang II抑制巨噬细胞AMPK/SIRT1通路的活化的细胞模型进一步探讨其具体机制。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

Ang II（SIGMA,SML0142），Lipofec-tamine 3000转 染 试 剂 盒（Invitrogen，L3000075），DMED-F12（Gibco，C11875500BT）；胎牛血清（Gibco，10091148）；0.25%EDTA 胰酶（Gibco，25100-056）；青霉素/链霉素（Gibco，15140-122）；活性氧ROS 试剂盒（南京建成，E004）；SOD试剂盒（南京建成，A001-3）；MDA试剂盒（南京建成，A003-1）；AT1 抗体（Affinity，DF4910）PAMPK 抗体（Abcam，ab18528）；AMPK 抗体（CST，5832S）；SIRT1 抗体（Santa，SC-515045）；β-actin 抗体（Boster，BM0627）；Anti-Rabbi（CST，7074S）；Anti-Mouse（CST，7076S）。

1.2 仪器与设备

Western blot 电泳仪（型号：PowerPacTM HC，BIO-RAD）；化学发光成像仪（型号：TANON 5200，TANON）。激光共聚焦荧光显微镜（型号：LSM800，ZEISS）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 小鼠巨噬细胞（RAW264.7）购于ATCC。RAW264.7 细胞的培养用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM-F12 完全培养基，37 ℃的5%CO2细胞培养箱。将细胞接种到6 孔板，待细胞融合度达60%时，给予不同浓度的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L）刺激，24 h后进行试验。

1.3.2 Western blot 检测 AT1，AMPK，P-AMPK,SIRT1的表达，RIPA 细胞裂解液（Themor Scientific,Rockford,USA）提取各分组的总蛋白，用BCA（碧云天）试剂盒测定浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，然后金属浴100 ℃蛋白变性5 min，于-20 ℃保存。配制12%分离胶和5%浓缩胶进行凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移到0.22 μmol/L PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别用AT1，AMPK，P-AMPK，SIRT1，β-actin 抗体孵育，先室温孵育1 h，然后4 ℃过夜，TBST洗3次后，二抗孵育2 h，TBST 洗3 次，再使用ECL 法曝光显影。采用Image J 软件进行对蛋白条带灰度值的计算。

1.3.3 检测SOD 和MDA 的表达 96 孔板接种细胞，待RAW264.7细胞融合度达60%时给予Ang II 刺激，24 h后吸取细胞上清液，用来检测SOD活性和MDA表达量。

1.3.4 实时细胞检测仪检测细胞ROS 96孔板接种细胞，1万/孔巨噬细胞，5～6 h后给予不同浓度的Ang II干预，刺激24 h后，吸出细胞培养基，用含DCFH-DA探针20 μmol/L的PBS避光37 ℃孵育细胞30 min，然后用PBS清洗细胞2遍，最后加入150 μL/孔PBS，放入实时细胞检测仪里，用其荧光显微镜拍照记录。

1.3.5 shRNA细胞转染 巨噬细胞内AT1R 受体的沉默运用shRNA 技术，利用CRISPR 设计工（gttp：//crispr.mit.edu/）编辑CRISPR/Cas9 系统的AT1R受体的基因序列，shRNA 序列合成后，由BBSl酶切导入PX459质粒中。AT1R 受体shRNA 的序列为：5'-CTTTCTTCT AAATCTCGCCC-3'。采用Lipofectamine 3000转染试剂盒转染细胞。

1.3.6 ROS 抑制剂干预 将细胞接种到六孔板中，分组为Ang II刺激组和Apocynin抑制组，贴壁后用20 μmol/L Ang II以及100 μmol/L Apocynin刺激细胞24 h，提取蛋白。

1.4 统计学方法

用SPSS17.0 对数据进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差表示，多组间采用单因素方差分析进行统计，两组间采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang II抑制巨噬细胞AMPK/SIRT1信号通路

分别给予RAW264.7不同浓度的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L），刺激24 h后检测P-AMPK、AMPK、SIRT-1 蛋白的表达量。与对照组相比，0.5～10 μmol/L的Ang II 的干扰对细胞蛋白的表达无明显变化，但20 μmol/L的Ang II的刺激能显著抑制蛋白AMPK的磷酸化（图1A、B），同时抑制SIRT1 的表达（图1C、D）。

2.2 Ang II活化巨噬细胞的氧化应激反应

分别不同浓度剂量的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L）刺激巨噬细胞，刺激24 h后用实时细胞检测仪显微镜拍照细胞内ROS 的荧光强度。结果显示，与对照组相比，0.5～10 μmol/L Ang II 处理后细胞的ROS 的释放没有明显增加，而20 μmol/L 的Ang II刺激明显增加了细胞ROS的释放（图2A、B）。在检测SOD活性和MDA表达量时，0.5～10 μmol/L的Ang II对细胞无明显改变，20 μmol/L的AngII明显抑制SOD 活性（图2C），能显著增加MDA的产生（图2D）。

图1 Angiotensin II 对巨噬细胞AMPK/SIRT1 信号通路的影响Fig.1 Effect of angiotensin II on AMPK/SIRT1 signaling pathway in macrophages. A, B: Western blotting of AMPK and p-AMPK in angiotensin II-treated macrophages(n=3).*P＜0.05 vs 0 μmol/L.C,D:Western blotting of SIRT1 in angiotensin II-treated macrophages(n=3).*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

2.3 shAT1R 巨噬细胞阻断了Ang II 对AMPK/SIRT1信号通路的抑制作用

将细胞分为scramble组和shAT1R组，给予20μmol/L有效剂量Ang II的刺激，24 h后检测P-AMPK、AMPK、SIRT1蛋白的表达量。Scramble 组与对照组相比，刺激组的AMPK 的磷酸化和SIRT1蛋白的表达量均减少；但shAT1R组中，与对照组相比较，Ang II 刺激后细胞的AMPK的磷酸化水平和SIRT1蛋白的表达量均没有明显改变（图3）。

图2 Angiotensin II 对巨噬细胞的氧化应激反应的影响Fig.2 Effect of angiotensin II on oxidative stress response in macrophages.A,B:Quantitative analysis of ROS expression stained with DCFH-DA by flow cytometry.C:SOD activity in RAW264.7 cells stimulated with 0,0.5,1,3,10,and 20 μmol/L angiotensin II.D:MDAlevels in RAW264.7 cells stimulated with 0,0.5,1,3,10,and 20 μmol/Langiotensin II.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

2.4 shAT1R巨噬细胞抑制Ang II对活性氧的释放

将细胞分为scramble 组和shAT1R 组，给予20 μmol/L有效剂量Ang II的刺激，24 h后分别检测细胞内ROS 的释放量，以及SOD 活性和MDA 的表达量。单纯对比Ang II刺激组，scramble组的ROS释放量和MDA的表达量明显高于shAT1R组，且scramble组的SOD活性低于shAT1R组（图4）。

2.5 ROS 抑制剂APO 能阻断Ang II 对AMPK/SIRT1信号通路的抑制作用

将细胞分为对照组、Ang II刺激组和APO 抑制剂组，Ang II刺激组给予20 μmol/L有效剂量Ang II的刺激，APO抑制剂组在给予20 μmol/L 有效剂量Ang II的刺激的同时，加入100 μmol/L的APO处理24 h。结果显示，与Ang II刺激组相比，APO抑制剂组中AMPK的磷酸化和SIRT1蛋白的表达水平有所增加。

图3 Angiotensin II 对shAT1R 巨噬细胞AMPK/SIRT1 信号通路的影响Fig.3 Effect of angiotensin II on AMPK/SIRT1 signaling pathway in macrophages with AT1R gene silencing.A, B: Western blotting showing the efficiency of AT1R gene silencing (*P＜0.05). C, D: Western blotting showing the effects of Ang II and AT1R gene silencing on the expressions of AMPK and p-AMPK(n=3).**P＜0.05;##P＜0.01.E,F:Western blotting showing the effects of Ang II and AT1R gene silencing on the expression of SIRT1 (n=3).**P＜0.05.##P＜0.01.

3 讨论

本研究证明了在巨噬细胞中，过多的ROS合成可以抑制AMPK/SIRT1信号通路激活。结果证明，Ang II激活AT1受体会促进ROS的合成增加，从而抑制了磷酸化AMPK和SIRT1的表达，shRNA敲减AT1受体后会抑制巨噬细胞中ROS的生成以及促进AMPK磷酸化水平和SIRT1的表达。使用ROS抑制剂APO可以阻断AT1受体激活后对AMPK磷酸化水平和SIRT1蛋白表达的抑制作用。

AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞代谢中充当能量传感器［14］。SIRT1主要位于细胞核中，它参与了心脏中能量产生，氧化应激，细胞凋亡和细胞内信号传导的生物学功能［15-16］。SIRT1是一种AMPK调控的NAD+依赖性蛋白去乙酰化酶，AMPK可以通过增加NAD+/NADPH比值来充当SIRT1激活剂，同时SIRT1也能调节AMPKα的活性［17-19］。文献报道AMPK/SIRT1通路可以调节血管紧张素II在体内和体外诱导心脏肥大和损伤［20］，使用基因突变小鼠模型的研究表明SIRT1 具有抗动脉粥样硬化的作用，过表达SIRT1减轻了Ang II诱导的小鼠血管重构和高血压［21］。炎症与心血管疾病的发病机制和预后密切相关，巨噬细胞在心血管疾病中扮演着重要作用角色［22-23］。近年来有文献报道，血管紧张素Ⅱ处理的小鼠体内巨噬细胞向M1型转化，炎症反应增加，出现血压升高，血管功能障碍的现象。其机制可能与巨噬细胞的AMPK/SIRT1信号通路有关［24-25］。本研究数据表明，在20 μmol/LAng II的刺激下，巨噬细胞中磷酸化的AMPK的表达水平降低，SIRT1的蛋白表达下降，这说明Ang II在巨噬细胞中能抑制AMPK/SIRT信号通路的活化。

氧化应激反应代表细胞内存在过多的活性氧（ROS），可促进炎症反应的发生并极大地促进心血管疾病的发展。细胞通过连续产生活性氧，以调节细胞的增殖，分化和凋亡等反应［20,26］。Ang II可以通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶刺激ROS的产生并引起炎症［27］。本研究实验数据证明了Ang II能诱导巨噬细胞的ROS 的过度释放，抑制超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低了细胞清除由于细胞新陈代谢产生废物的能力，增加了氧化终产物丙二醛表达量。

图4 Angiotensin II 对shAT1R 巨噬细胞氧化应激的影响Fig.4 Effect of angiotensin II on oxidative stress response in macrophages with AT1R gene silencing. A, B: Western blotting showing the efficiency of AT1R gene silencing (**P＜0.01). C, D: Quantitative analysis of ROS expression in the macrophages stained with DCFH-DA by flow cytometry(*P＜0.05;#P＜0.05).E:Effect of 20 μmol/L angiotensin II stimulation on SOD activity in RAW264.7 cells transfected with in scramble and shAT1R constructs(*P＜0.05;#P＜0.05).F:Effect og 20 μmol/L angiotensin II on MDAlevel in RAW264.7 cells transfected with in scramble and shAT1R constructs(*P＜0.05;#P＜0.05).

血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的关键分子之一。AT1受体促进多种细胞内信号通路，导致高血压、内皮功能障碍、血管重塑和终末器官损伤。通过激活AT1，血管紧张素（Ang）II驱动血流动力学损伤，随后单核细胞和其他炎症细胞在高血压期间进入心脏、血管和肾脏［28］。目前文献报道激活AT1受体对巨噬细胞的功能有影响。巨噬细胞中的AT1可以调控NF-kappaB的活性，AT1的激活会促进脂质的积累、迁移和细胞因子的产生，同时使动脉粥样硬化病变内巨噬细胞群的分布向促炎性M1表型发展，减少M2巨噬细胞的表型，巨噬细胞中AT1受体敲除后，阻碍了UNX对M2巨噬细胞表型的转化的影响［29］。有文献报道，使用AT1 受体拮抗剂替米沙坦会增加AMPK 的磷酸化水平，促进AMPK信号通路的活化来抑制内质网应激［30］。为了验证巨噬细胞中AT1受体和AMPK/SIRT1的关系，在本实验中，成功沉默了巨噬细胞的AT1R受体后，发现Ang II的刺激对AMPK的磷酸化无影响，同时SIRT1蛋白的表达量也没有变化，证明在巨噬细胞中Ang II是通过AT1 受体对AMPK/SIRT1通路进行调控的。在动脉粥样硬化模型中，选择性血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂氯沙坦可抑制ROS的产生［31］。为了验证巨噬细胞中AT1受体是否会影响ROS的合成，本研究在敲除AT1受体的巨噬细胞中，检测ROS的水平。实验结果证明沉默AT1 受体后，Ang II无法增加ROS的合成，以及抑制了抗氧化酶SOD的活性。

有文章报道ROS 可以作用于AMPKα 亚基上对氧化还原敏感的半胱氨酸残基（Cys-299/Cys-304）来调控AMPK的活性［32］，另外使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸可以降低SIRT1的磷酸化［33］。为了进一步验证巨噬细胞中ROS跟AMPK/SIRT1的关系，本研究使用ROS的抑制剂APO后，Ang II的刺激不能减弱AMPK 磷酸化水平，也无法降低SIRT1 的蛋白表达量，这证明Ang II 通过AT1 受体促进ROS 氧化应激反应来调控AMPK/SIRT1信号通路。

图5 抑制巨噬细胞氧化应激反应对AMPK/SIRT1 的影响Fig.5 Effect of inhibition of oxidative stress response on AMPK/SIRT1 signaling in macrophages.A, B: Western blotting for detecting the expression of p-AMPK (n=3). C, D: Western blotting for the expression of SIRT1(n=3).**P＜0.01;#P＜0.05.

综上所述，本文确定了Ang II通过AT1受体可以调控巨噬细胞中的氧化应激反应，从而抑制AMPK/SIRT1信号通路的活化。揭示了AT1受体在Ang II诱导的氧化应激反应中的重要作用。