石淋通颗粒HPLC指纹图谱研究

占丽琴 马 杰 罗 艳 李瑞莲*

1.湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001

石淋通颗粒为广金钱草经提取加工制成，具有清湿热、利尿、排石的作用，用于尿路结石、肾盂肾炎、胆囊炎[1]。现行标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第八册及国家药品标准WS3-B-1520-93-1、WS3-B-1520-93-2 、WS3-B-1520-93-3、WS-11044(ZD-1044)-2002-2011Z、国家药品标准修订批件2000ZFB 0058所附石淋通颗粒质量标准等5个注册标准，检验项目较少，无法全面评价其质量。而有关文献仅对广金钱草进行夏佛塔苷、总黄酮的含量测定[2-3]。中药制剂的成分复杂，在质量控制中采用单一或几个成分难以控制其整体质量[4-6]。故本实验建立HPLC指纹图谱，并确定其中几个共有峰的成分，从整体上控制该制剂的整体质量。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪；AE200 型电子分析天平(德国梅特勒公司)；KQ-300TZ型超声波清洗器(300W，30KHZ)；UV-TOC/UF型超纯水系统(赛默飞)。 石淋通颗粒来自20家不同医药公司生产的20批次样品，编号S1-S20，批号：171004、171003、170902、17070008、171002、17110032、1710006、1709009、170301、20170601、1710020、170502、171001、170902、20171110、667001、1709261、20170201、171201、170801)；广金钱草(批号：121248-201104) 、夏佛塔苷(批号：111912-201703)均购自中国食品药品检定研究院；新西兰牡荆苷2(批号：B21399)、异夏佛塔苷(批号：B21563)均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)，等度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：335 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别取新西兰牡荆苷2、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成浓度分别为13.52 μg/mL、33.04 μg/mL、26.02 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品适量(相当于广金钱草2 g)，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，在 “2. 1”项色谱条件下连续测定6次，记录色谱图，以夏佛塔苷峰为参照峰，计算其他特征峰的相对保留时间，结果均小于1.0%，说明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批石淋通颗粒，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样6次测定，记录色谱图，以夏佛塔苷为参照峰，计算其他特征峰的相对保留时间，结果均小于1.0%，说明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液 10 μL，在 “2.1”项色谱条件下于配制后的0、4、8、12、20、24 h进样测定，记录色谱图，以夏佛塔苷为参照峰，计算其他特征峰的相对保留时间，结果均小于2.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 石淋通颗粒指纹图谱的建立与相似度评价 取20批石林通颗粒，依“2.2.2” 项方法制备供试品溶液并进样测定，记录图谱，标记为S1～S20。20批样品共标出10个共有峰，经与对照品比对，指认3个特征峰，分别为新西兰牡荆苷2(3号峰)、夏佛塔苷(7号峰)、异夏佛塔苷(10号峰)，以7号峰作为参照峰(S)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，见图1、表1、表2。

将相关数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)，以S1(171004)样品为参照，经过多点校正和数据匹配后，平均值法生成对照指纹图谱R，与对照指纹图谱比较20批石淋通颗粒的相似度数据，相似度均大于0.990，说明石淋通颗粒的质量稳定，见表3。

表1 20批样品各峰的相对保留时间

表2 20批样品各峰的相对峰面积

2.4.2 石淋通颗粒指纹图谱的聚类分析 以所得20批样品指纹图谱的10个共有峰的峰面积为变量，导入SPSS 22.0软件，选用平均组间连接聚类方法，以平方欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，结果如图2所示。当分类距离为20时，20批次石淋通颗粒可以分为2大类，S4、S12、S13、S17、S19号样品聚为一类；其余样品聚为一类。

表3 20批石淋通颗粒与对照指纹图谱比较的相似度

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 分别比较甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效果。结果表明，80%甲醇的提取溶液中的色谱峰较其他2种提取溶液中的色谱峰更为丰富，因此选择80%甲醇为提取溶剂。同时参考广金钱草在《2015版中国药典一部》的含量测定方法，采用超声震荡的提取方法。

3.2 检测波长的选择 使用PDA检测器对样品进行210～400 nm的全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在335 nm下检测到峰的数目较多，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息以反映体系组成的全貌，因此选定335 nm为检测波长。

3.3 流动相的选择 由于石淋通颗粒化学成分简单，剂型范围小，故选择等度洗脱。在流动相的筛选中，考察了乙腈-0.4%磷酸水系统、甲醇-0.4%磷酸水系统。结果显示，乙腈-0.4%磷酸水系统的基线更稳定，色谱峰个数较多，且拥有较好的分离度，因此选择乙腈-0.4%磷酸水系统为HPLC分析的流动相系统。

3.4 色谱柱的选择 考察3种不同型号色谱柱：Ecosil C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)、Agilent zorbax SB-C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)、Apollo C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，结果表明Agilent zorbax SB-C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)柱分离出的色谱峰分离度好，峰数多，稳定性好，故选择Agilent zorbax SB-C18柱为分析色谱柱。

3.5 参照峰的选择 广金钱草标准收录于《中国药典》(2015年版一部)，其含量测定项目的指标成分为夏佛塔苷。石淋通颗粒为广金钱草的单方制剂，本研究建立的指纹图谱10个特征峰中夏佛塔苷的峰面积最大、峰形好，与广金钱草的指标成分一致，最后选择夏佛塔苷为参照峰(S峰)。在下一阶段研究中，可以参考广金钱草中夏佛塔苷的含量，对本制剂中的夏佛塔苷进行定量研究。

4 结论

本研究运用HPLC法建立了石淋通颗粒的指纹图谱，基本反映了该品种的化学成分全貌，为全面控制石淋通颗粒的质量提供一个新方法。通过对指纹图谱的分析，确定了10个特征峰，以夏佛塔苷的峰为参照峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%以内。具体规定值为：0.41(峰1)、0.57(峰2)、0.61(峰3)、0.65(峰4)、0.70(峰5)、0.862(峰6)、1.000(峰7,S)、1.237(峰8)、1.289(峰9)、1.455(峰10)。